In vitro Ensaio de Morte de Hemácias Infectadas por Plasmodium por Linfócitos Citotóxicos
Summary
Aqui descrevemos um novo método para ajudar a elucidar os mecanismos de imunidade celular ao Plasmodium durante a fase sanguínea da infecção. Este é um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas por linfócitos citotóxicos.
Abstract
A malária é um importante problema de saúde pública, apresentando mais de 200 milhões de casos por ano em todo o mundo. Apesar de anos de esforços científicos, a imunidade protetora contra a malária ainda é pouco compreendida, principalmente devido às limitações metodológicas da cultura de Plasmodium a longo prazo, especialmente para Plasmodium vivax. A maioria dos estudos tem se concentrado na proteção da imunidade adaptativa contra a malária por anticorpos, que desempenham um papel fundamental no controle da malária. Entretanto, a proteção estéril induzida pelas vacinas atenuadas contra esporozoítos de Plasmodium está relacionada à resposta celular, principalmente aos linfócitos T citotóxicos, como as células T CD8+ e gama delta (γδ T). Assim, novas metodologias devem ser desenvolvidas para melhor compreender as funções da resposta imune celular e, assim, subsidiar futuras terapias e o desenvolvimento de vacinas. Para encontrar uma nova estratégia para analisar essa imunidade mediada por células à infecção por Plasmodium no estádio sanguíneo, nosso grupo estabeleceu um ensaio in vitro que mede a morte de hemácias infectadas (iRBC) por linfócitos citotóxicos. Este ensaio pode ser usado para estudar mecanismos de resposta imune celular contra diferentes Plasmodium spp. Células imunes citotóxicas inatas e adaptativas podem eliminar diretamente as hemácias e o parasita intracelular em um mecanismo efetor :alvo. As hemácias alvo são marcadas para avaliar a viabilidade celular e cocultivadas com células efetoras (células CD8+ T, γδ T, NK, etc.). A porcentagem de lise é calculada com base nas condições testadas, em comparação com um controle de lise espontânea em um ensaio baseado em citometria de fluxo. Em última análise, esta metodologia de ensaio de morte é um grande avanço na compreensão da imunidade mediada por células à malária em estágio sanguíneo, ajudando a descobrir novos alvos terapêuticos potenciais e acelerar o desenvolvimento de vacinas contra a malária.
Introduction
A malária continua sendo uma crise de saúde global, com mais de 240 milhões de casos e 627.000 mortes relacionadas à malária relatadas em 20201. Atualmente, existem cinco espécies parasitas que podem causar malária em humanos, das quais Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax são as duas espécies mais prevalentes. Durante a infecção por Plasmodium , o fígado ou estágio pré-eritrocítico é assintomático, e os sintomas só ocorrem durante o ciclo assexuado do parasita na fase eritrocitária. Nesta fase de infecção, milhares de merozoítos derivados da fase hepática são liberados na corrente sanguínea e infectam os glóbulos vermelhos (hemácias). Nas hemácias, os parasitas diferenciam-se em trofozoítos e esquizoítos por esquizogonia, até que os esquizontes rompam o eritrócito, liberando merozoítos recém-formados, repetindo esse ciclo sanguíneo. Ciclos repetidos de invasão, replicação e liberação de merozoítos resultam em um crescimento exponencial da população de parasitos e, finalmente, desencadeiam sintomas da doença2.
Um desafio importante no estudo da resposta imune à malária é que o Plasmodium spp. que infecta humanos não infecta modelos animais de laboratório. Assim, amostras de pacientes infectados por Plasmodium devem ser coletadas frescas e imediatamente processadas e analisadas. No entanto, em áreas endêmicas de malária, os recursos para acessar mecanismos imunológicos e moleculares são limitados. Devido a essas limitações, roedores são amplamente utilizados como modelos experimentais para investigar a resposta imune contra a infecção por Plasmodium. Enquanto P. berghei e P. chabaudi são frequentemente usados como substitutos para a infecção por P. falciparum, a cepa não-letal de P. yoelii 17XNL também tem muitas características em comum com P. vivax, como infecção restrita a reticulócitos 3,4. O desenvolvimento de ensaios in vitro de Plasmodium, que podem ser utilizados para amostras derivadas de modelos humanos ou animais, é valioso para obter uma melhor compreensão da patogênese da malária e comparar a resposta imunológica provocada por diferentes espécies do parasita.
A imunidade protetora antimalárica não é completamente compreendida nem na fase pré-eritrocitária nem na fase sanguínea. Sabe-se que a exposição a infecções repetidas resulta em imunidade parcial adquirida, mas a imunidade estéril raramente é desenvolvida5. Durante décadas, a imunidade protetora anti-Plasmodium esteve associada principalmente à indução de anticorpos neutralizantes ou opsonizantes que impedem a invasão parasitária das células hospedeiras ou levam à fagocitose por células apresentadoras de antígenos, respectivamente6. Como resultado, a maioria dos esforços para produzir vacinas antimaláricas até o momento tem contado com a indução de anticorpos protetores e de longa duração 7,8. Entretanto, a proteção estéril induzida pela vacinação com esporozoíto atenuado correlaciona-se diretamente com a ativação e expansão de linfócitos T citotóxicos 8,9.
Recentemente, alguns estudos com amostras de pacientes recém-isoladas e culturas in vitro demonstraram que células imunes citotóxicas inatas ou adaptativas, como células CD8+ T 10, γδ T11 e NK12, podem eliminar diretamente hemácias infectadas por Plasmodium e seu parasita intracelular de maneira efetor:alvo. Esses achados seminais definiram um mecanismo efetor imunológico inteiramente novo no contexto da malária. Para dissecar essa nova imunidade antimalárica, é essencial explorar mecanismos efetores citotóxicos de células assassinas contra hemácias infectadas (iRBCs) em infecção natural ou vacinação.
Apresentamos aqui um ensaio in vitro que mede a atividade citotóxica dos linfócitos contra a malária na fase sanguínea. Este ensaio pode então ajudar a elucidar os mecanismos da resposta imune celular contra o estágio eritrocitário do Plasmodium . As células-alvo, iRBCs, são marcadas com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) para avaliar a viabilidade celular, e são então cocultivadas com células efetoras como linfócitos citotóxicos (CTL). Esta cocultura é então avaliada por citometria de fluxo, usando marcadores fluorescentes para tipos celulares específicos. Finalmente, a porcentagem de lise de iRBC por CTL é calculada dividindo-se a condição experimental pela ruptura espontânea das hemácias e controle da lise espontânea, que ocorre durante a incubação sem a célula efetora. Em geral, esta metodologia de ensaio de morte pode contribuir para uma melhor compreensão da imunidade da malária mediada por células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um ensaio in vitro para medir a morte de hemácias infectadas por Plasmodium por linfócitos citotóxicos. Este ensaio pode ajudar a elucidar os mecanismos da imunidade protetora celular ao estágio eritrocítico do parasita da malária. A principal vantagem desta metodologia é que ela fornece um ensaio quantitativo da morte mediada por células de iRBCs que pode ser usado para abordar muitas questões sobre como as células imunes interagem com diferentes Plasmodium spp.
…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Dhelio Pereira e aos membros do Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Rondônia (CEPEM) pelo cadastramento e coleta de sangue dos pacientes com malária e à Felicia Ho pelo auxílio na revisão do manuscrito. O seguinte reagente foi obtido através da BEI Resources, NIAID, NIH: Plasmodium yoelii subsp . Esta pesquisa foi financiada pelo Fundo Lemann de Amparo à Pesquisa do Brasil, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) – 437851/2018-4, bolsas (CJ, GC, CG) e Fundação de Amparo do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) – APQ-00653-16, APQ-02962-18; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – fellowship (LL).
Materials
| 100 μM cell strainer | Corning | 431752 | |
| 96 Well Round (U) Bottom Plate | Thermo Scientific | 12-565-65 | |
| Anti-human CD235a (Glycophorin A) Antibody | Biolegend | 349114 | Used – APC anti-human CD235, dilution 1:100 |
| Anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317314 | Used – PB anti-human CD3, dilution 1:200 |
| Anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344714 | Used – APC/Cy7 anti-human CD8, dilution 1:200 |
| Anti-human TCR Vδ2 Antibody | Biolegend | 331408 | Used – PE anti-human TCR Vδ2, dilution 1:200 |
| Anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100733 | Used- PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a, dilution 1:200 |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody | Biolegend | 116223 | Used – APC/Cyanine7 anti-mouse TER-119, dilution 1:200 |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified | Gibco | 26140079 | |
| Ficoll-Paque Plus | Cytiva | 17144003 | Lymphocyte Separation Medium (LSM) |
| Heparin Sodium Injection, USP | meithel pharma | 71228-400-003 | Used – 2000 USP units/2mL |
| Isoflurane | Piramal critical care | 66794-0013-25 | |
| LS MACS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| LSRFortessa Cell Analyzer | BD Bioscience | ||
| Percoll | Cytiva | 17089101 | Density Gradient Separation Medium (DGSM) |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | |
| Sodium bicarbonate, powder, BioReagent | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe With Sub-Q needle – 1mL, 26 gauge; | BD | 14-829-10F | |
| Vacutainer Heparin Tube Glass Green 10 ml | BD | 366480 |
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