Détection et quantification de nanotubes à effet tunnel à l’aide d’images 3D Volume View
Summary
Les nanotubes à effet tunnel (TNT) sont principalement des nanotubes à membrane F-actine ouverts qui relient les cellules voisines, facilitant ainsi la communication intercellulaire. La caractéristique notable qui distingue les TNT des autres protubérances cellulaires est la nature planante des nanotubes entre les cellules. Ici, nous caractérisons les TNT en construisant une vue de volume 3D d’images confocales z-stack.
Abstract
Des découvertes récentes ont révélé que les cellules effectuent un transfert intercellulaire direct à longue portée via des conduits actine-membrane à l’échelle nanométrique, à savoir des « nanotubes tunneling » (TNT). Les TNT sont définis comme des extensions membranaires ouvertes et entourées de bicouches lipidiques qui assurent la continuité entre les cellules voisines de diamètres compris entre 50 nm et 1 μm. Les TNT ont été initialement démontrés dans les cellules neuronales, mais des études successives ont révélé l’existence de TNT dans plusieurs types de cellules et maladies, telles que les maladies neurodégénératives, les infections virales et le cancer. Plusieurs études ont fait référence à des nanostructures membranaires à couplage électrique rapproché entre des cellules voisines en tant que TNT ou structures de type TNT.
L’élucidation de l’ultrastructure en termes de continuité membranaire à l’extrémité est techniquement difficile. En outre, les études sur la communication cellule-cellule sont difficiles en termes de caractérisation des TNT à l’aide de méthodes conventionnelles en raison de l’absence de marqueurs spécifiques. Les TNT sont principalement définis comme des protubérances membranaires ouvertes à base de F-actine. Cependant, une limitation majeure est que la F-actine est présente dans tous les types de protubérances, ce qui rend difficile la différenciation des TNT des autres protubérances. L’une des caractéristiques notables des TNT à base de F-actine est que ces structures oscillent entre deux cellules sans toucher le substrat. Par conséquent, les TNT distincts colorés à la F-actine peuvent être distingués d’autres protubérances telles que les filopodies et les neurites en fonction de leur vol stationnaire entre les cellules.
Nous avons récemment montré que l’internalisation de l’amyloïde-βoligomère 1-42 (oAβ) via l’endocytose actine-dépendante stimule la kinase-1 activée par p21 (PAK1), qui intervient dans la formation de TNT contenant de la F-actine coexprimée avec phospho-PAK1 entre les cellules neuronales SH-SY5Y. Ce protocole décrit une méthode d’analyse de volume 3D pour identifier et caractériser les TNT à partir des images z-stack capturées des protubérances membranaires immunocolorées F-actine et phospho-PAK1 dans les cellules neuronales traitées oAβ. De plus, les TNT se distinguent du développement de neurites et d’excroissances neuronales basées sur des conduits membranaires immunocolorés par la tubuline F-actine et β-III.
Introduction
Les nanotubes tunneliers (TNT) sont des conduits à membrane à base de F-actine, principalement ouverts, et jouent un rôle essentiel dans le transfert intercellulaire de cargaison et d’organites1. La caractéristique unique des TNT est qu’ils connectent des cellules voisines sans aucun contact avec le substrat; Ils mesurent plus de 10 à 300 μm de long et leur diamètre varie entre 50 nm et 1 μm 2,3. Les TNT sont des structures transitoires et leur durée de vie dure de quelques minutes à plusieurs heures. Les TNT ont d’abord été démontrés dans les cellules neuronales PC121; Plus tard, de nombreuses études ont montré leur existence dans plusieurs types cellulaires in vitro et in vivo 4,5. Plusieurs études ont révélé l’importance pathologique des TNT dans divers modèles de maladies, telles que les maladies neurodégénératives, le cancer et les infections virales 6,7,8.
Les hétérogénéités structurelles des TNT ont été démontrées par plusieurs études dans divers systèmes cellulaires9. Les différences sont basées sur la composition du cytosquelette, le mécanisme de formation et les types de cargaison transférés10. Principalement, la continuité membranaire ouverte et F-actine positive qui plane entre deux cellules voisines et transfère des organites est considérée comme constituée de TNT11. Cependant, le manque de clarté ou de diversité observé dans la formation des TNT ajoute à la difficulté de développer des marqueurs spécifiques au TNT. Ainsi, il est difficile d’identifier les structures TNT par des méthodes de détection conventionnelles et de distinguer les nanotubes membranaires en termes de protubérances ouvertes et fermées12. Cependant, la caractéristique des TNT de planer sous forme de protubérances de la membrane F-actine entre deux cellules est relativement plus facile et plus réalisable à identifier à l’aide de techniques d’imagerie conventionnelles. D’autres protubérances cellulaires à base d’actine telles que les filopodia et les filopodia dorsales ne peuvent pas planer entre deux cellules éloignées, en particulier lorsque les cellules sont fixes. Il convient de noter que les neurites en développement à extrémité fermée, couplées électriquement, sont souvent appelées structures de type TNT13.
On sait que la F-actine joue un rôle important dans la formation de TNT, et plusieurs études ont montré que l’inhibiteur de la F-actine cytochalasine D inhibe la formation de TNT14,15. En revanche, les inhibiteurs des microtubules n’ont aucun effet sur la formation de TNT16. Les 2 dernières décennies ont vu plusieurs rapports sur le rôle important que jouent les TNT dans la propagation de la pathologie et de la résistance tumorale et de la thérapie17. Par conséquent, il existe une demande sans fin pour de meilleures techniques de caractérisation du TNT.
L’absence de marqueurs spécifiques des TNT et la diversité de la morphologie et de la composition du cytosquelette rendent difficile le développement d’une méthode unique de caractérisation. Certaines études ont utilisé des techniques automatisées de détection d’images et de quantification TNT18,19. Cependant, la méthode actuelle d’analyse manuelle de volume 3D présente plusieurs avantages par rapport à l’analyse automatique d’images pour la détection et la quantification des TNT. Souvent, des yeux humains entraînés peuvent repérer ces nanostructures en vol stationnaire plus facilement qu’une méthode de détection d’images automatisée. De plus, les méthodes de détection automatique pourraient être difficiles à mettre en œuvre dans des laboratoires dépourvus d’expertise en algorithmes. La méthode actuelle pourrait être largement adoptée par les chercheurs en raison de sa précision et de sa reproductibilité.
Dans une étude récente, nous avons montré que l’oAβ favorise la biogenèse des TNT dans les cellules neuronales via un mécanisme d’endocytose médié par PAK1, dépendant de l’actine12. Les TNT induits par oAβ expriment également PAK1 activé (ou phospho-PAK1). Nous avons développé une méthode de reconstruction d’images en vue de volume 3D pour distinguer les TNT immunocolorés par oAβ, F-actine et phospho-PAK1. Les neurones en développement positifs à la tubuline β-III ressemblent souvent à des structures planantes de type TNT20. Par conséquent, nous avons en outre distingué les TNT à base de F-actine des neurites positifs à la tubuline β-III et d’autres protubérances de type TNT. Les images de volume 3D ont été utilisées pour identifier les TNT sur la base de leurs caractéristiques de vol stationnaire au-dessus du substrat et de rester connectés entre deux cellules voisines. Cet article décrit l’identification et la détection de conduits membranaires contenant de l’actine ou de TNT à l’aide d’images confocales z-stack et, enfin, la quantification manuelle des structures identifiées à partir d’images de reconstruction de vue de volume 3D. La méthode présentée ne permet pas de distinguer les TNT propres ouverts des structures fermées de type TNT; cette méthode permet d’identifier les TNT en culture cellulaire 2D in vitro sur un substrat plat. Cependant, la méthode est facile à mettre en œuvre et à reproduire et peut être largement utilisée pour la quantification précise des TNT à base d’actine et pour les distinguer des neurites et des structures de type TNT positives à la β-tubuline.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs chercheurs au cours des 2 dernières décennies ont essayé de comprendre et de caractériser la structure des TNT18. L’absence de marqueurs spécifiques entrave les progrès, et il existe une demande croissante pour une méthode pratique et normalisée qui peut être utilisée pour identifier, caractériser et quantifier les TNT. Les TNT sont définis comme des conduits membranaires à base de F-actine qui planent entre deux cellules. Des études ont montré que les β-tubuline positi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.K.V et A.R remercient l’Académie d’enseignement supérieur de Manipal pour la bourse TMA Pai. Nous remercions le Science and Engineering Research Board of India pour SERB-SRG (#SRG/2021/001315), ainsi que le Conseil indien de la recherche médicale de l’Inde (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) et le fonds intra-muros de l’Académie d’enseignement supérieur de Manipal, Manipal, Inde. Nous remercions l’installation confocale du JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Inde) et B. Suma pour la microscopie confocale du JNCASR.
Materials
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
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