터널링 나노 튜브 (TNT)는 주로 인접한 세포를 연결하여 세포 간 통신을 촉진하는 개방형 F- 액틴 막 나노 튜브입니다. TNT를 다른 세포 돌출부와 구별하는 주목할만한 특징은 세포 사이의 나노 튜브의 호버링 특성입니다. 여기에서는 컨포칼 z-스택 이미지의 3D 볼륨 뷰를 구성하여 TNT의 특성을 분석합니다.
최근의 발견에 따르면 세포는 나노 크기의 액틴-막 도관, 즉 “터널링 나노 튜브”(TNT)를 통해 직접적이고 장거리 세포 간 전달을 수행합니다. TNT는 50nm에서 1μm 사이의 직경을 가진 이웃 세포 사이의 연속성을 매개하는 개방형 지질 이중층으로 둘러싸인 막 확장으로 정의됩니다. TNT는 처음에는 신경 세포에서 입증되었지만 연속적인 연구에서 신경 퇴행성 질환, 바이러스 감염 및 암과 같은 여러 세포 유형 및 질병에서 TNT의 존재가 밝혀졌습니다. 여러 연구에서 이웃 세포 사이의 폐쇄형, 전기 결합 막 나노 구조를 TNT 또는 TNT 유사 구조로 언급했습니다.
종말점에서의 막 연속성 측면에서 미세 구조의 해명은 기술적으로 어렵습니다. 또한, 세포-세포 통신에 대한 연구는 특정 마커가 없기 때문에 종래의 방법을 사용한 TNT의 특성 분석 측면에서 도전적이다. TNT는 주로 F- 액틴 기반의 개방형 막 돌출부로 정의됩니다. 그러나 한 가지 주요 한계는 F- 액틴이 모든 유형의 돌출부에 존재하여 TNT를 다른 돌출부와 구별하기가 어렵다는 것입니다. F- 액틴 기반 TNT의 주목할만한 특징 중 하나는 이러한 구조가 지층을 건드리지 않고 두 세포 사이를 맴돌고 있다는 것입니다. 따라서, 별개의 F- 액틴 염색 TNT는 세포 사이의 호버링에 기초하여 필로 포디아 및 신경 돌기와 같은 다른 돌출부와 편리하게 구별 될 수있다.
우리는 최근 액틴 의존성 엔도 사이토 시스를 통한 올리고머 아밀로이드 -β1-42 (oAβ)의 내재화가 활성화 된 p21- 활성화 키나아제 -1 (PAK1)을 자극하여 SH-SY5Y 신경 세포 사이에서 phospho-PAK1과 공동 발현되는 F- 액틴 함유 TNT의 형성을 매개한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 oAβ 처리된 신경 세포에서 F-액틴 및 포스포-PAK1-면역염색 막 돌출부의 캡처된 z-스택 이미지에서 TNT를 식별하고 특성화하기 위한 3D 부피 분석 방법을 설명합니다. 또한, TNT는 F- 액틴 – 및 β -III 튜 불린 – 면역 염색 막 도관을 기반으로 한 신경 돌기 및 신경 세포 파생물을 개발하는 것과 구별된다.
터널링 나노 튜브 (TNT)는 F- 액틴 기반의 주로 개방형 막 도관이며화물 및 세포 기관의 세포 간 이동에 중요한 역할을합니다1. TNT의 독특한 특징은 지층과의 접촉없이 이웃 세포를 연결한다는 것입니다. 길이는 10-300 μm 이상이며 직경은 50 nm에서 1 μm 2,3 사이입니다. TNT는 일시적인 구조이며 수명은 몇 분에서 몇 시간 사이입니다. TNT는 PC12 뉴런 세포1에서 처음 입증되었습니다. 나중에 수많은 연구에서 시험관 내 및 생체 내여러 세포 유형에서 존재하는 것으로 나타났습니다 4,5. 여러 연구에서 신경 퇴행성 질환, 암 및 바이러스 감염 6,7,8과 같은 다양한 질병 모델에서 TNT의 병리학 적 중요성이 밝혀졌습니다.
TNT의 구조적 이질성은 다양한 세포 시스템에서 여러 연구에 의해 입증되었습니다9. 차이점은 세포 골격 구성, 형성 메커니즘 및 이송 된화물 유형을 기반으로합니다10. 주로, 두 개의 인접한 세포 사이를 맴돌고 세포 기관을 전달하는 개방형 F- 액틴 양성 막 연속성은 TNT11로 구성된 것으로 간주됩니다. 그러나 TNT 형성에서 관찰되는 명확성 또는 다양성의 부족은 TNT 특이 적 마커를 개발하는 데 어려움을 더합니다. 따라서, 종래의 검출 방법에 의해 TNT 구조를 동정하고, 개방형 및 폐쇄 단부 돌출부(12)의 관점에서 막 나노튜브를 구별하는 것은 어렵다. 그러나, 두 세포 사이의 F-액틴 막 돌출부로서 호버링하는 TNTs의 특성은 종래의 이미징 기술을 사용하여 식별하기가 상대적으로 쉽고 실현 가능하다. 필로포디아 및 등쪽 필로포디아와 같은 다른 액틴 기반 세포 돌출부는 특히 세포가 고정된 경우 멀리 있는 두 세포 사이를 맴돌 수 없습니다. 참고로, 폐쇄되고 전기적으로 결합되어 발달하는 신경돌기는 종종 TNT 유사 구조(13)라고 불립니다.
F- 액틴은 TNT 형성에 중요한 역할을하는 것으로 알려져 있으며, 여러 연구에서 F- 액틴 억제제 사이토 칼라 신 D가 TNT14,15의 형성을 억제한다는 것이 밝혀졌습니다. 대조적으로, 미세소관의 억제제는 TNT 형성16에 어떠한 영향도 미치지 않는다. 지난 2 년 동안 TNT가 병리학 및 종양 내성 및 치료의 확산에서 중요한 역할을한다는 여러 보고서가있었습니다17. 따라서 TNT 특성화를 위한 더 나은 기술에 대한 끝없는 요구가 있습니다.
TNT의 특정 마커가 부족하고 형태 및 세포 골격 구성의 다양성으로 인해 고유 한 특성 분석 방법을 개발하기가 어렵습니다. 일부 연구는 자동 이미지 검출 및 TNT 정량화 기술을 사용했습니다18,19. 그러나, TNT의 검출 및 정량화를 위한 자동 이미지 분석에 비해 현재의 3D 부피 수동 분석 방법의 몇 가지 장점이 있다. 종종 훈련된 인간의 눈은 자동화된 이미지 감지 방법보다 이러한 호버링 나노 구조를 더 쉽게 발견할 수 있습니다. 또한 자동 검출 방법은 알고리즘 전문 지식이 부족한 실험실에서 구현하기 어려울 수 있습니다. 현재의 방법은 정밀도와 재현성으로 인해 연구자들에 의해 널리 채택 될 수 있습니다.
최근 연구에서 우리는 oAβ가 PAK1 매개 액틴 의존성 엔도 사이토 시스 메커니즘을 통해 신경 세포에서 TNT의 생물 발생을 촉진한다는 것을 보여주었습니다12. oAβ-유도 TNT는 또한 활성화된 PAK1 (또는 포스포-PAK1)을 발현한다. 우리는 oAβ 유도, F- 액틴 및 포스 포 -PAK1- 면역 염색 TNT를 구별하기 위해 3D 부피보기 이미지 재구성 방법을 개발했습니다. β-III 튜 불린 양성, 발달 신경돌기는 종종 TNT와 같은 호버링 구조와 유사합니다20. 따라서 우리는 F- 액틴 기반 TNT를 β-III 튜 불린 양성 신경 돌기 및 기타 TNT 유사 돌출부와 구별했습니다. 3D 볼륨 뷰 이미지는 지층 위로 마우스를 가져가고 인접한 두 셀 사이에 연결된 상태를 유지하는 특성을 기반으로 TNT를 식별하는 데 사용되었습니다. 이 백서에서는 컨포칼 z-스택 이미지를 사용하여 액틴 함유 막 도관 또는 TNT를 식별 및 검출하고, 마지막으로 3D 볼륨 뷰 재구성 이미지에서 식별된 구조를 수동으로 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 제시된 방법은 개방형 적절한 TNT와 폐쇄형 TNT 유사 구조를 구별할 수 없습니다. 이 방법은 평평한 지층에서 시험 관 내 2D 세포 배양에서 TNT를 식별하는 데 도움이 됩니다. 그러나 이 방법은 구현 및 재현이 용이하며 액틴계 TNT만을 정밀하게 정량하고 신경돌기 및 β튜불린 양성 TNT 유사 구조와 구별하는 데 널리 사용될 수 있습니다.
지난 2 년 동안 여러 연구자들은 TNT18의 구조를 이해하고 특성화하려고 노력해 왔습니다. 특정 마커의 부족은 진행을 방해하고 TNT를 식별, 특성화 및 정량화하는 데 사용할 수 있는 편리하고 표준화된 방법에 대한 수요가 증가하고 있습니다. TNT는 두 세포 사이를 맴도는 F-액틴 기반 막 도관으로 정의됩니다. 연구에 따르면 β 튜 불린 양성, 폐쇄 종말, 발달 신경 돌기는 두 개의 먼 …
The authors have nothing to disclose.
D.K.V와 A.R은 TMA Pai 펠로우십에 대해 Manipal Academy of Higher Education에 감사드립니다. SERB-SRG(#SRG/2021/001315)에 대한 인도 과학 및 공학 연구 위원회와 인도 의학 연구 위원회(#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) 및 인도 마니팔에 있는 마니팔 고등 교육 아카데미의 교내 기금에 감사드립니다. JNCASR (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) 공초점 시설과 B. Suma에 JNCASR의 컨포칼 현미경에 감사드립니다.
35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |