Detektion und Quantifizierung von tunnelnden Nanoröhren mittels 3D-Volumenansichtsbildern
Summary
Tunnelnde Nanoröhren (TNTs) sind in erster Linie offene F-Aktin-Membran-Nanoröhren, die benachbarte Zellen verbinden und die interzelluläre Kommunikation erleichtern. Das bemerkenswerte Merkmal, das TNTs von anderen Zellvorsprüngen unterscheidet, ist die schwebende Natur der Nanoröhrchen zwischen den Zellen. Hier charakterisieren wir TNTs, indem wir eine 3D-Volumenansicht von konfokalen Z-Stack-Bildern erstellen.
Abstract
Jüngste Entdeckungen haben gezeigt, dass Zellen einen direkten, langreichweitigen interzellulären Transfer über Aktinmembrankanäle im Nanobereich durchführen, nämlich “tunnelnde Nanoröhren” (TNTs). TNTs sind definiert als offene, lipid-doppelschichtige Membranverlängerungen, die die Kontinuität zwischen benachbarten Zellen mit Durchmessern zwischen 50 nm und 1 μm vermitteln. TNTs wurden zunächst in neuronalen Zellen nachgewiesen, aber aufeinanderfolgende Studien haben die Existenz von TNTs in verschiedenen Zelltypen und Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, Virusinfektionen und Krebs gezeigt. Mehrere Studien haben sich auf geschlossene, elektrisch gekoppelte Membran-Nanostrukturen zwischen benachbarten Zellen als TNTs oder TNT-ähnliche Strukturen bezogen.
Die Aufklärung der Ultrastruktur in Bezug auf die Membrankontinuität am Endpunkt ist technisch anspruchsvoll. Darüber hinaus sind Studien zur Zell-Zell-Kommunikation aufgrund des Fehlens spezifischer Marker eine Herausforderung hinsichtlich der Charakterisierung von TNTs mit herkömmlichen Methoden. TNTs werden in erster Linie als F-Aktin-basierte, offene Membranvorsprünge definiert. Eine wesentliche Einschränkung ist jedoch, dass F-Aktin in allen Arten von Vorsprüngen vorhanden ist, was es schwierig macht, TNTs von anderen Vorsprüngen zu unterscheiden. Eine der bemerkenswerten Eigenschaften von F-Aktin-basierten TNTs ist, dass diese Strukturen zwischen zwei Zellen schweben, ohne das Substrat zu berühren. Daher können unterschiedliche F-Aktin-gefärbte TNTs bequem von anderen Vorsprüngen wie Filopodien und Neuriten unterschieden werden, basierend auf ihrem Schweben zwischen den Zellen.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass die Internalisierung von oligomerem Amyloid-β1-42 (oAβ) über Aktin-abhängige Endozytose die aktivierte p21-aktivierte Kinase-1 (PAK1) stimuliert, die die Bildung von F-Aktin-haltigen TNTs vermittelt, die mit Phospho-PAK1 zwischen SH-SY5Y-neuronalen Zellen koexprimiert werden. Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Volumenanalysemethode zur Identifizierung und Charakterisierung von TNTs aus den aufgenommenen z-Stack-Bildern von F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten Membranvorsprüngen in oAβ-behandelten neuronalen Zellen. Darüber hinaus unterscheiden sich TNTs von der Entwicklung von Neuriten und neuronalen Auswüchsen auf Basis von F-Aktin- und β-III-Tubulin-immungefärbten Membranleitungen.
Introduction
Tunneling Nanotubes (TNTs) sind F-Aktin-basierte, hauptsächlich offene Membrankanäle und spielen eine wichtige Rolle beim interzellulären Transfer von Fracht und Organellen1. Das einzigartige Merkmal von TNTs ist, dass sie benachbarte Zellen ohne Kontakt mit dem Substrat verbinden; Sie sind über 10-300 μm lang und ihre Durchmesser variieren zwischen 50 nm und 1 μm 2,3. TNTs sind vorübergehende Strukturen, und ihre Lebensdauer dauert zwischen einigen Minuten und mehreren Stunden. TNTs wurden erstmals in PC12-Nervenzellen nachgewiesen1; Später zeigten zahlreiche Studien ihre Existenz in mehreren Zelltypen in vitro und in vivo 4,5. Mehrere Studien haben die pathologische Bedeutung von TNTs in verschiedenen Krankheitsmodellen wie neurodegenerativen Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen gezeigt 6,7,8.
Die strukturellen Heterogenitäten von TNTs wurden durch mehrere Studien in verschiedenen zellulären Systemen nachgewiesen9. Die Unterschiede beruhen auf der Zusammensetzung des Zytoskeletts, dem Mechanismus der Bildung und den übertragenen Frachttypen10. In erster Linie wird angenommen, dass die offene, F-Aktin-positive Membrankontinuität, die zwischen zwei benachbarten Zellen schwebt und Organellen überträgt, aus TNTs11 besteht. Der Mangel an Klarheit oder Vielfalt, der bei der Bildung von TNTs beobachtet wird, trägt jedoch zur Schwierigkeit bei der Entwicklung von TNT-spezifischen Markern bei. Daher ist es schwierig, TNT-Strukturen mit herkömmlichen Detektionsmethoden zu identifizieren und Membrannanoröhren in Bezug auf offene und geschlossene Vorsprünge zu unterscheiden12. Die Eigenschaft von TNTs, als F-Aktin-Membranvorsprünge zwischen zwei Zellen zu schweben, ist jedoch mit herkömmlichen bildgebenden Verfahren relativ einfacher und praktikabler zu identifizieren. Andere Aktin-basierte zelluläre Vorsprünge wie Filopodien und dorsale Filopodien können nicht zwischen zwei entfernten Zellen schweben, insbesondere wenn Zellen fixiert sind. Bemerkenswert ist, dass geschlossene, elektrisch gekoppelte, sich entwickelnde Neuriten oft als TNT-ähnliche Strukturen bezeichnetwerden 13.
Es ist bekannt, dass F-Aktin eine wichtige Rolle bei der TNT-Bildung spielt, und mehrere Studien haben gezeigt, dass der F-Aktin-Inhibitor Cytochalasin D die Bildung von TNTs14,15 hemmt. Im Gegensatz dazu haben Inhibitoren von Mikrotubuli keinen Einfluss auf die TNT-Bildung16. In den letzten 2 Jahrzehnten gab es mehrere Berichte über die bedeutende Rolle, die TNTs bei der Ausbreitung von Pathologie und Tumorresistenz und Therapie spielen17. Daher gibt es eine nie endende Nachfrage nach besseren Techniken zur TNT-Charakterisierung.
Das Fehlen spezifischer TNT-Marker und die Vielfalt in Morphologie und Zusammensetzung des Zytoskeletts erschweren die Entwicklung einer einzigartigen Charakterisierungsmethode. Einige Studien haben automatisierte Bilderkennungs- und TNT-Quantifizierungstechniken verwendet18,19. Es gibt jedoch mehrere Vorteile der derzeitigen manuellen 3D-Volumenanalysemethode gegenüber der automatischen Bildanalyse zur Detektion und Quantifizierung von TNTs. Oft können geschulte menschliche Augen diese schwebenden Nanostrukturen leichter erkennen als eine automatisierte Bilddetektionsmethode. Darüber hinaus könnten automatische Nachweismethoden in Laboratorien ohne Algorithmus-Know-how schwierig zu implementieren sein. Die vorliegende Methode könnte aufgrund ihrer Präzision und Reproduzierbarkeit von Forschern weitgehend übernommen werden.
In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass oAβ die Biogenese von TNTs in neuronalen Zellen über einen PAK1-vermittelten, Aktin-abhängigen Endozytose-Mechanismus fördert12. oAβ-induzierte TNTs exprimieren auch aktiviertes PAK1 (oder Phospho-PAK1). Wir entwickelten eine 3D-Volumenansichts-Bildrekonstruktionsmethode zur Unterscheidung von oAβ-induzierten, F-Actin- und Phospho-PAK1-immungefärbten TNTs. β-III-Tubulin-positive, sich entwickelnde Neuriten ähneln oft TNT-ähnlichen schwebenden Strukturen20. Daher unterschieden wir F-Actin-basierte TNTs weiter von β-III-Tubulin-positiven Neuriten und anderen TNT-ähnlichen Vorsprüngen. 3D-Volumenansichtsbilder wurden verwendet, um TNTs anhand ihrer Eigenschaften zu identifizieren, über dem Substrat zu schweben und zwischen zwei benachbarten Zellen verbunden zu bleiben. Dieser Artikel beschreibt die Identifizierung und Detektion von Aktin-haltigen Membrankanälen oder TNTs unter Verwendung konfokaler Z-Stack-Bilder und schließlich die manuelle Quantifizierung der identifizierten Strukturen aus 3D-Volumenansichtsrekonstruktionsbildern. Das vorgestellte Verfahren kann keine offenen TNTs von geschlossenen TNT-ähnlichen Strukturen unterscheiden; Diese Methode hilft, TNTs in In-vitro-2D-Zellkultur auf einem flachen Substrat zu identifizieren. Die Methode ist jedoch einfach zu implementieren und zu reproduzieren und kann weit verbreitet sein, um nur Aktin-basierte TNTs genau zu quantifizieren und sie von Neuriten und β-Tubulin-positiven TNT-ähnlichen Strukturen zu unterscheiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Forscher haben in den letzten 2 Jahrzehnten versucht, die Struktur von TNTs18 zu verstehen und zu charakterisieren. Das Fehlen spezifischer Marker behindert den Fortschritt, und es besteht eine zunehmende Nachfrage nach einer praktischen, standardisierten Methode, mit der TNTs identifiziert, charakterisiert und quantifiziert werden können. TNTs sind definiert als F-Aktin-basierte Membranleitungen, die zwischen zwei Zellen schweben. Studien haben gezeigt, dass β-Tubulin-positive, geschlos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.K.V und A.R danken der Manipal Academy of Higher Education für das TMA Pai-Stipendium. Wir danken dem Science and Engineering Research Board of India für SERB-SRG (#SRG/2021/001315) sowie dem Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) und dem Intramural Fund der Manipal Academy of Higher Education, Manipal, Indien. Wir danken der konfokalen Einrichtung des JNCASR (Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research, Indien) und B. Suma für die konfokale Mikroskopie in JNCASR.
Materials
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
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