Deteksjon og kvantifisering av tunnelerende nanorør ved hjelp av 3D-volumvisningsbilder
Summary
Tunneling nanorør (TNTs) er primært åpne F-aktin membran nanorør som forbinder naboceller, noe som letter intercellulær kommunikasjon. Den bemerkelsesverdige egenskapen som skiller TNT fra andre cellefremspring er den svevende naturen til nanorørene mellom celler. Her karakteriserer vi TNT-er ved å konstruere en 3D-volumvisning av konfokale z-stack-bilder.
Abstract
Nylige funn har avslørt at celler utfører direkte, langdistanse, intercellulær overføring via nanoskala, aktinmembranledninger, nemlig “tunneling nanorør” (TNTs). TNT er definert som åpne, lipid dobbeltlagsomkransede membranutvidelser som formidler kontinuitet mellom naboceller med diametre mellom 50 nm og 1 μm. TNT ble først demonstrert i nevronceller, men suksessive studier har avslørt eksistensen av TNT i flere celletyper og sykdommer, som nevrodegenerative sykdommer, virusinfeksjoner og kreft. Flere studier har referert til nære, elektrisk koblede membrannanostrukturer mellom naboceller som TNT eller TNT-lignende strukturer.
Belysning av ultrastruktur i form av membrankontinuitet ved endepunktet er teknisk utfordrende. I tillegg er studier på celle-cellekommunikasjon utfordrende når det gjelder karakterisering av TNT ved bruk av konvensjonelle metoder på grunn av mangel på spesifikke markører. TNT er primært definert som F-aktinbaserte, åpne membranfremspring. En stor begrensning er imidlertid at F-aktin er tilstede i alle typer fremspring, noe som gjør det utfordrende å skille TNT fra andre fremspring. En av de bemerkelsesverdige egenskapene til F-aktinbaserte TNT-er er at disse strukturene svever mellom to celler uten å berøre substratumet. Derfor kan distinkte F-aktinfargede TNT-er enkelt skilles fra andre fremspring som filopodi og nevritter basert på at de svever mellom celler.
Vi har nylig vist at internalisering av oligomer amyloid-β 1-42 (oAβ) via aktinavhengig endocytose stimulerer aktivert p21-aktivert kinase-1 (PAK1), som medierer dannelsen av F-aktinholdige TNTer coexpressed med fosfo-PAK1 mellomSH-SY5Y nevronceller. Denne protokollen skisserer en 3D-volumanalysemetode for å identifisere og karakterisere TNT-er fra de fangede z-stack-bildene av F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained membranfremspring i oAβ-behandlede nevronceller. Videre skiller TNTer seg fra å utvikle nevritter og nevronale utvekster basert på F-aktin- og β-III tubulinimmunostained membranledninger.
Introduction
Tunneling nanorør (TNTs) er F-aktinbaserte, primært åpne membranledninger og spiller en viktig rolle i intercellulær overføring av last og organeller1. Den unike egenskapen til TNT-er er at de forbinder naboceller uten kontakt med substratumet; De er over 10-300 μm lange og diametrene varierer mellom 50 nm og 1 μm 2,3. TNT er forbigående strukturer, og deres levetid varer mellom noen få minutter til flere timer. TNT ble først vist i PC12 nevronceller1; Senere viste mange studier deres eksistens i flere celletyper in vitro og in vivo 4,5. Flere studier har avdekket den patologiske betydningen av TNT i ulike sykdomsmodeller, som nevrodegenerative sykdommer, kreft og virusinfeksjoner 6,7,8.
De strukturelle heterogenitetene til TNT har blitt demonstrert av flere studier i ulike cellulære systemer9. Forskjellene er basert på cytoskelettsammensetning, dannelsesmekanismen og lasttypene som overføres10. Primært anses den åpne, F-aktinpositive membrankontinuiteten som svinger mellom to naboceller og overføringsorganeller å bestå av TNTs11. Mangelen på klarhet eller mangfold observert i dannelsen av TNT legger imidlertid til vanskeligheten med å utvikle TNT-spesifikke markører. Dermed er det vanskelig å identifisere TNT-strukturer ved konvensjonelle deteksjonsmetoder og skille membrannanorør når det gjelder åpne og lukkede fremspring12. Imidlertid er karakteristikken for TNT-er å sveve som F-aktinmembranfremspring mellom to celler relativt enklere og mer gjennomførbart å identifisere ved hjelp av konvensjonelle bildebehandlingsteknikker. Andre aktinbaserte cellulære fremspring som filopodi og dorsal filopodi kan ikke sveve mellom to fjerne celler, spesielt når celler er faste. Merk at nært, elektrisk koblet, utviklende nevritter ofte kalles TNT-lignende strukturer13.
Det er kjent at F-aktin spiller en viktig rolle i TNT-dannelsen, og flere studier har vist at F-aktinhemmeren cytochalasin D hemmer dannelsen av TNT14,15. Hemmere av mikrotubuli har derimot ingen effekt på TNT-dannelse16. De siste 2 tiårene har sett flere rapporter om den betydelige rollen som TNT spiller i spredning av patologi og tumorresistens og terapi17. Derfor er det en uendelig etterspørsel etter bedre teknikker for TNT-karakterisering.
Mangelen på spesifikke markører for TNT og mangfoldet i morfologi og cytoskeletal sammensetning gjør det vanskelig å utvikle en unik karakteriseringsmetode. Noen studier har brukt automatisert bildedeteksjon og TNT-kvantifiseringsteknikker18,19. Det er imidlertid flere fordeler med den nåværende manuelle 3D-volumanalysemetoden fremfor automatisk bildeanalyse for deteksjon og kvantifisering av TNT-er. Ofte kan trente menneskelige øyne oppdage disse svevende nanostrukturene lettere enn en automatisert bildedeteksjonsmetode. Videre kan automatiske deteksjonsmetoder være vanskelige å implementere i laboratorier som mangler algoritmekompetanse. Den nåværende metoden kan bli allment vedtatt av forskere på grunn av sin presisjon og reproduserbarhet.
I en nylig studie viste vi at oAβ fremmer biogenesen av TNT i nevronceller via en PAK1-mediert, aktinavhengig endocytosemekanisme12. oAβ-induserte TNTer uttrykker også aktivert PAK1 (eller fosfo-PAK1). Vi utviklet en 3D-volumvisningsbilde-rekonstruksjonsmetode for å skille mellom oAβ-induserte, F-aktin- og fosfo-PAK1-immunstained TNTs. β-III tubulin-positive, utviklende neuritter ligner ofte TNT-lignende svevende strukturer20. Derfor skilte vi videre F-aktinbaserte TNTer fra β-III tubulin-positive nevritter og andre TNT-lignende fremspring. 3D-volumvisningsbilder har blitt brukt til å identifisere TNT-er på grunnlag av deres egenskaper ved å sveve over underlaget og holde kontakten mellom to naboceller. Dette papiret beskriver identifisering og deteksjon av aktinholdige membranrør eller TNT-er ved hjelp av konfokale z-stack-bilder og til slutt manuell kvantifisering av de identifiserte strukturene fra rekonstruksjonsbilder av 3D-volumvisning. Den presenterte metoden kan ikke skille åpne riktige TNT-er fra nære TNT-lignende strukturer; denne metoden bidrar til å identifisere TNT i in vitro 2D-cellekultur på et flatt substratum. Metoden er imidlertid enkel å implementere og reprodusere og kan brukes mye til presis kvantifisering av bare aktinbaserte TNT-er og for å skille dem fra nevritter og β-tubulinpositive TNT-lignende strukturer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere forskere de siste 2 tiårene har forsøkt å forstå og karakterisere strukturen til TNTs18. Mangelen på spesifikke markører hindrer fremgang, og det er en økende etterspørsel etter en praktisk, standardisert metode som kan brukes til å identifisere, karakterisere og kvantifisere TNTs. TNTs er definert som F-aktinbaserte membranledninger som svinger mellom to celler. Studier har vist at β-tubulin-positive, nære, utviklende nevritter svever mellom to fjerne celler og ligner TNT-lignend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
D.K.V og A.R takker Manipal Academy of Higher Education for TMA Pai-fellesskapet. Vi takker Science and Engineering Research Board of India for SERB-SRG (#SRG/2021/001315), samt Indian Council of Medical Research of India (#5/4-5/Ad-hoc/Neuro/216/2020-NCD-I) og Intramural fund of Manipal Academy of Higher Education, Manipal, India. Vi takker JNCASRs (Jawaharlal Nehru Center for Advanced Scientific Research, India) konfokalanlegg og B. Suma for konfokalmikroskopi i JNCASR.
Materials
| 35 mm dish with 14 mm well size made of #1.5 cover slip | Cellvis | D35-14-1.5-N | Imaging dish used to seed cells for staining experiments |
| Aβ (1-42) 1 mg | AnaSpec | #64129 | Oligomers of amyloid beta to treat the cells |
| Alexa flour 488 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A11070 | Secondary antibody for phospho-PAK1 |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific (MSC Advantage) | 51025411 | Provide aspetic conditions duirng cell culture |
| CO2 Incubator | Thermo Electron Corporation (Heraeus Hera Cell 240) | 51026556 | For growing cells at or near body temperature |
| Confocal Laser Scanning Microscope | ZEISS (Carl Zeiss) | LSM 880 | Able to generate three-dimensional images of large specimen at super-resolution |
| DABCO [1,4-Diazobicyclo-(2,2,2) octane] | Merck | 8034560100 | Anti-bleaching reagent |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | D9542-1MG | Neuclear stainer |
| DMEM media | Gibco | 11965092 | Used for the preparation of 100uM of Aβ (1-42) |
| DMEM/F12 (1:1 mixture of DMEM and Ham’s F12) | Gibco | 12500062 | Culture media for SH-SY5Y |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Cell culture grade | Cryopur | CP-100 | Cell culture grade used as dissolving agent for Retinoic acid |
| DMSO (Dimethyl sulphide) Molecular grade | Himedia | MB058 | Used as one of the dissolving agent for the lyophilized Aβ (1-42) |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000044 | Major supplement for Culture media (US origin) |
| Formalin Fixative (Neutral buffered 10%) | Sigma Aldrich | HT5014-120ML | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| Glutaraldehyde (Grade I, 25% in H2O) | Sigma | G5882 | Component in the Karnovsky's fixative solution |
| HFIP (1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol ) solution | TCI | H024 | Used to dissolve Aβ (1-42) 1 mg |
| Image Processing/ Analysis Software: FIJI (ImageJ) | National Institute of Health (NIH) | Used to process/analyze the images and to differentiate the TNTs from neurites using its plugin named "volume viewer". | |
| Lyophilizer | Christ, Alpha | 2.4 LDplus | 0.05 mg aliquots of Aβ (1-42) can be stored in -20 °C after lyophilization only |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin Mixture | Thermo fisher Scientific | 15640055 | Antibiotic mixture |
| Phalloidin-iFlor 555 | Abcam | ab176756 | F-actin binding stain |
| Phospho-PAK1 (Thr423) /PAK2 (Thr402) [Rabbit] | CST | #2601 | Primary antibody |
| Polyclonal Antibody to Tubulin Beta 3 (TUBb3) | Cloud clone | PAE711Hu01 | Primary antibody |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Differentiating reagent |
| Saponin | Merck | 8047-15-2 | Detergent used in the Incubation buffer in immunostaining |
| Water bath sonicator (Quart, Drain valve Heater) | Ultrasonic Cleaner | 3.0 L/3.2 | Sonicator used to dissolve Aβ (1-42) stock, after DMSO adding to it during the preparation of 100 µM Aβ (1-42) |
| ZEN Microscopy software | ZEISS (Carl Zeiss) | Imaging software to acquire confocal microscopy images with smart automation |
References
- Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport. Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).
- Desir, S., et al. Chemotherapy-induced tunneling nanotubes mediate intercellular drug efflux in pancreatic cancer. Scientific Reports. 8, 9484 (2018).
- Cordero Cervantes, D., Zurzolo, C. Peering into tunneling nanotubes-The path forward. The EMBO Journal. 40 (8), 105789 (2021).
- Dieriks, B. V., et al. α-synuclein transfer through tunneling nanotubes occurs in SH-SY5Y cells and primary brain pericytes from Parkinson’s disease patients. Scientific Reports. 7, 42984 (2017).
- Chen, J., Cao, J. Astrocyte-to-neuron transportation of enhanced green fluorescent protein in cerebral cortex requires F-actin dependent tunneling nanotubes. Scientific Reports. 11, 16798 (2021).
- Mittal, R., et al. Cell communication by tunneling nanotubes: Implications in disease and therapeutic applications. Journal of Cellular Physiology. 234 (2), 1130-1146 (2019).
- Polak, R., de Rooij, B., Pieters, R., den Boer, M. L. B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia cells use tunneling nanotubes to orchestrate their microenvironment. Blood. 126 (21), 2404-2414 (2015).
- Panasiuk, M., Rychlowski, M., Derewonko, N., Bienkowska-Szewczyk, K. Tunneling nanotubes as a novel route of cell-to-cell spread of herpesviruses. Journal of Virology. 92 (10), 00090 (2018).
- Austefjord, M. W., Gerdes, H. H., Wang, X. Tunneling nanotubes: Diversity in morphology and structure. Communicative & Integrative Biology. 7 (1), 27934 (2014).
- Han, X., Wang, X. Opportunities and challenges in tunneling nanotubes research: How far from clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2306 (2021).
- Zurzolo, C. Tunneling nanotubes: Reshaping connectivity. Current Opinion in Cell Biology. 71, 139-147 (2021).
- Dilna, A., et al. Amyloid-beta induced membrane damage instigates tunneling nanotube-like conduits by p21-activated kinase dependent actin remodulation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease. 1867 (12), 166246 (2021).
- Chang, M., et al. Formation of cellular close-ended tunneling nanotubes through mechanical deformation. Science Advances. 8 (13), (2022).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Letters. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Zhang, J., et al. Direct observation of tunneling nanotubes within human mesenchymal stem cell spheroids. The Journal of Physical Chemistry B. 122 (43), 9920-9926 (2018).
- Hanna, S. J., et al. The role of Rho-GTPases and actin polymerization during Macrophage Tunneling Nanotube Biogenesis. Scientific Reports. 7, 8547 (2017).
- Raghavan, A., Rao, P., Neuzil, J., Pountney, D. L., Nath, S. Oxidative stress and Rho GTPases in the biogenesis of tunnelling nanotubes: Implications in disease and therapy. Cellular and Molecular Life Sciences. 79, 36 (2021).
- Abounit, S., Delage, E., Zurzolo, C. Identification and characterization of tunneling nanotubes for intercellular trafficking. Current Protocols in Cell Biology. 67, 11-21 (2015).
- Hodneland, E., et al. Automated detection of tunneling nanotubes in 3D images. Cytometry A. 69 (9), 961-972 (2006).
- Wang, X., Bukoreshtliev, N. V., Gerdes, H. H. Developing neurons form transient nanotubes facilitating electrical coupling and calcium signaling with distant astrocytes. PLoS One. 7 (10), 47429 (2012).
- Nath, S., et al. Spreading of neurodegenerative pathology via neuron-to-neuron transmission of beta-amyloid. Journal of Neuroscience. 32 (26), 8767-8777 (2012).
- Domert, J., et al. Spreading of amyloid-beta peptides via neuritic cell-to-cell transfer is dependent on insufficient cellular clearance. Neurobiology of Disease. 65, 82-92 (2014).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, Pixels, and Gray Levels: Digitizing Image Data. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Pontes, B., et al. Structure and elastic properties of tunneling nanotubes. European Biophysics Journal. 37 (2), 121-129 (2008).
- Haimovich, G., Gerst, J. E. Detection of mRNA transfer between mammalian cells in coculture by single-molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH). Methods in Molecular Biology. 2038, 109-129 (2019).
- Janardhan, K. S., Jensen, H., Clayton, N. P., Herbert, R. A. Immunohistochemistry in investigative and toxicologic pathology. Toxicologic Pathology. 46 (5), 488-510 (2018).
- Qin, Y., et al. The combination of paraformaldehyde and glutaraldehyde is a potential fixative for mitochondria. Biomolecules. 11 (5), 711 (2021).
- Graham, R. C., Karnovsky, M. J. The histochemical demonstration of monoamine oxidase activity by coupled peroxidatic oxidation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 13 (7), 604-605 (1965).
