Hochgeschwindigkeitsschnitt des menschlichen Temporalknochens zur Beurteilung der COVID-19-assoziierten Mittelohrpathologie
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Technik für die schnelle Durchtrennung von menschlichen Schläfenknochen, bei der eine Mikrosäge mit Zwillingsdiamantklingen verwendet wird, um dünne Scheiben für die schnelle Entkalkung und Analyse der Immunhistochemie des Schläfenbeins zu erzeugen.
Abstract
Die histopathologische Analyse von menschlichen Schläfenbeinabschnitten ist eine grundlegende Technik zur Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie. Schläfenknochenabschnitte werden durch postmortale Temporalknochenernte, Fixierung, Entkalkung, Einbettung und Färbung hergestellt. Aufgrund der Dichte des Schläfenbeins ist die Entkalkung ein zeit- und ressourcenintensiver Prozess; Die vollständige Gewebepräparation kann durchschnittlich 9-10 Monate dauern. Dies verlangsamt die otopathologische Forschung und behindert zeitkritische Studien, wie sie für die COVID-19-Pandemie relevant sind. Dieses Papier beschreibt eine Technik zur schnellen Vorbereitung und Entkalkung von Schläfenbeinabschnitten, um die Gewebeverarbeitung zu beschleunigen.
Schläfenknochen wurden postmortal mit Standardtechniken geerntet und in 10% Formalin fixiert. Eine Präzisions-Mikrosäge mit zwei Diamantklingen wurde verwendet, um jeden Abschnitt in drei dicke Abschnitte zu schneiden. Dicke Schläfenknochenabschnitte wurden dann 7-10 Tage lang in Entkalkungslösung entkalkt, bevor sie in Paraffin eingebettet, mit einem Kryotom in dünne (10 μm) Abschnitte geschnitten und auf ungeladenen Objektträgern montiert wurden. Anschließend wurden Gewebeproben deparaffinisiert und zur Antikörperfärbung rehydriert (ACE2, TMPRSS2, Furin) und abgebildet. Diese Technik reduzierte die Zeit von der Ernte bis zur Gewebeanalyse von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage. Hochgeschwindigkeits-Schläfenbeinschnitte können die Geschwindigkeit der otopathologischen Forschung erhöhen und die für die Gewebepräparation erforderlichen Ressourcen reduzieren, während gleichzeitig zeitkritische Studien wie die im Zusammenhang mit COVID-19 erleichtert werden.
Introduction
Die Erforschung des menschlichen Temporalknochens bietet eine unschätzbare Ressource, um die Pathologie und Pathophysiologie des Innen- und Mittelohrs zu untersuchen. Vor dem 19. Jahrhundert war wenig über die otologische Erkrankung 1,2,3 bekannt. Um die otologische Erkrankung besser zu verstehen und “die Hörchirurgie aus den Händen von Quacksalbern zu retten”, entwickelte Joseph Toynbee (1815-1866) Methoden, um histologische Abschnitte des menschlichen Schläfenbeinszu untersuchen 3. Diese Arbeit wurde von Adam Politzer (1835-1920) in Wien und anderen in ganz Europa während des restlichen 19. Jahrhunderts gefördert, der Schläfenbeinabschnitte verwendete, um die Histopathologie vieler häufiger Erkrankungen des Ohres zu beschreiben 2,3,4.
Das erste Labor für menschliche Schläfenknochen in den Vereinigten Staaten wurde 1927 am Johns Hopkins Hospital eröffnet, wo Stacy Guild (1890-1966) Methoden für die Schläfenbeinschnitte 5,6 entwickelte. Die von Guild entwickelten Methoden bestanden aus einem 9-10-monatigen Prozess, der die postmortale Ernte, Fixierung, Entkalkung in Salpetersäure, Dehydratation in Ethanol, Celloidineinbettung, Schnitt, Färbung und Montage umfasste. Modifikationen an dieser Technik wurden später von Harold Schuknecht (1917-1996)7 vorgenommen; Die Grundkomponenten dieses Prozesses bleiben jedoch im Wesentlichen unverändert.
Die erheblichen Ressourcen, die für die Aufrechterhaltung eines Schläfenbeinlabors erforderlich sind, haben eine Herausforderung für die Schläfenknochenforschung darstellt und wahrscheinlich zu ihrer abnehmenden Popularität in den letzten 30 Jahren beigetragen 4,8. Ein erheblicher Teil der Laborressourcen für Schläfenknochen muss dem 9-10-monatigen Prozess der Schläfenknochenpräparation gewidmet werden. Einer der zeitaufwendigsten Schritte in der Vorbereitung ist die Entkalkung des Schläfenbeins, des dichtesten Knochens im menschlichen Körper. Die Entkalkung wird typischerweise in Salpetersäure oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) durchgeführt und dauert Wochen bis Monate, während ein häufiger Wechsel der Lösungenerforderlich ist 7,9. Darüber hinaus können zeitkritische Studien des menschlichen Ohrs, wie sie sich auf die COVID-19-Pandemie beziehen, durch diesen langsamen Vorbereitungsprozess behindert werden. Dieses Papier beschreibt eine Technik für Hochgeschwindigkeits-Schläfenknochenschnitte, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Abschnitte zu erzeugen, die eine schnelle Entkalkung und Gewebeanalyse innerhalb von 10-14 Tagen nach der Schläfenknochenernte ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Erforschung des menschlichen Schläfenbeins ist für die Untersuchung der Innen- und Mittelohrpathologie von entscheidender Bedeutung, bleibt aber ein zeit- und ressourcenintensives Unterfangen. Dieses Papier beschreibt eine Technik, die eine Diamant-Mikrosäge verwendet, um dicke Schläfenknochenabschnitte zu erzeugen, die vor dem weiteren Schneiden schnell entkalkt werden können, so dass die Zeit von der Gewebeernte bis zur Untersuchung von 9-10 Monaten auf 10-14 Tage verkürzt werden kann. Diese Technik kann die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mohamed Lehar für seine Unterstützung bei diesem Projekt. Diese Arbeit wurde teilweise von den National Institutes of Health (T32DC000027, NSA) unterstützt.
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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