Summary
이 기사에서는 트윈 다이아몬드 블레이드가있는 마이크로 소를 사용하여 측두골 면역 조직 화학의 신속한 탈석회화 및 분석을 위해 얇은 조각을 생성하는 신속한 인간 측두골 절편 기술을 설명합니다.
Abstract
인간의 측두골 절편의 조직병리학적 분석은 내이 및 중이 병리학을 연구하기 위한 근본적인 기술이다. 측두골 절편은 사후 측두골 수확, 고정, 탈석회화, 임베딩 및 염색에 의해 준비됩니다. 측두골의 밀도로 인해 탈석회화는 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 과정입니다. 완전한 조직 준비는 평균 9-10 개월이 걸릴 수 있습니다. 이것은 이비병리학 연구를 늦추고 COVID-19 전염병과 관련된 연구와 같이 시간에 민감한 연구를 방해합니다. 이 논문은 조직 처리 속도를 높이기 위해 측두골 절편의 신속한 준비 및 탈석회화 기술을 설명합니다.
측두골은 표준 기술을 사용하여 사후 수확하고 10% 포르말린으로 고정하였다. 트윈 다이아몬드 블레이드가 달린 정밀 마이크로 톱을 사용하여 각 섹션을 세 개의 두꺼운 섹션으로 절단했습니다. 두꺼운 측두골 절편을 파라핀에 매립하기 전에 7-10일 동안 탈석회화 용액에서 탈석회시키고, 냉동고를 사용하여 얇은 (10 μm) 절편으로 절편화하고, 충전되지 않은 슬라이드에 장착하였다. 이어서, 조직 샘플을 탈파라핀화하고 항체 염색 (ACE2, TMPRSS2, Furin)을 위해 재수화시키고, 이미지화하였다. 이 기술은 수확에서 조직 분석까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축했습니다. 고속 측두골 절제술은 이비병리학 연구의 속도를 높이고 조직 준비에 필요한 자원을 줄이는 동시에 COVID-19와 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있습니다.
Introduction
인간의 측두골 연구는 내이와 중이의 병리학 및 병리 생리학을 연구하는 데 귀중한 자원을 제공합니다. 19세기 이전에는 이비인후과 질환 1,2,3에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 이비인후과 질환을 더 잘 이해하고 "돌팔이의 손에서 청각 수술을 구하기"위해 Joseph Toynbee (1815-1866)는 인간 측두골의 조직 학적 섹션을 연구하는 방법을 개발했습니다3. 이 연구는 19 세기의 나머지 기간 동안 비엔나와 유럽 전역의 Adam Politzer (1835-1920)에 의해 촉진되었으며, 그는 측두골 섹션을 사용하여 귀 2,3,4에 영향을 미치는 많은 일반적인 조건의 조직 병리학을 설명했습니다.
미국 최초의 인간 측두골 실험실은 1927 년 존스 홉킨스 병원 (Johns Hopkins Hospital)에 문을 열었으며, 스테이시 길드 (Stacy Guild, 1890-1966)는 측두골 절편 5,6 방법을 개발했습니다. 길드가 개발 한 방법은 사후 수확, 고정, 질산에서의 탈석회화, 에탄올에서의 탈수, 셀로이드 임베딩, 절개, 염색 및 장착을 포함하는 9-10 개월 과정으로 구성되었습니다. 이 기술에 대한 수정은 나중에 Harold Schuknecht (1917-1996)7에 의해 이루어졌습니다. 그러나이 프로세스의 기본 구성 요소는 본질적으로 변경되지 않습니다.
측두골 실험실을 유지하는 데 필요한 중요한 자원은 측두골 연구에 대한 도전을 제시했으며 지난 30 년 동안 4,8 년 동안 인기가 감소하는 데 기여했을 가능성이 큽니다. 측두골 실험실 자원의 상당 부분은 측두골 준비의 9-10 개월 과정에 전념해야합니다. 준비에서 가장 시간이 많이 걸리는 단계 중 하나는 인체에서 가장 밀도가 높은 뼈 인 측두골의 탈석회화입니다. 탈석회화는 일반적으로 질산 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)에서 수행되며 용액 7,9를 자주 교체해야 하는 동안 몇 주에서 몇 달이 걸립니다. 또한, COVID-19 전염병과 관련된 것과 같이 인간의 귀에 대한 시간에 민감한 연구는 이러한 느린 준비 과정에 의해 방해받을 수 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 측두골 수확 후 10-14 일 이내에 신속한 탈석회화 및 조직 분석을 가능하게하는 두꺼운 섹션을 생성하는 고속 측두골 절편화 기술을 설명합니다.
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Protocol
이 프로토콜은 IRB (IRB00250002) 승인과 인간 조직 및 감염성 물질의 사용에 대한 제도적 정책에 따라 개발되었습니다. 각 측두골 기증자는 사망 전에 서면 동의를 제공했거나 기증자의 가족으로부터 사후 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 측두골 수확
- 이 프로토콜을 활용하기 전에 지역 기관 검토 위원회 (IRB) 이사회 승인을 받고, 인간 및 전염성 물질 사용에 대한 제도적 정책을 검토하고, 조직 기증에 대한 동의를 얻으십시오.
- COVID-19 양성 측두골 기증자의 조직으로 작업하기 전에 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. PPE가 N-95 인공 호흡기와 안면 보호막(또는 양압 공기 정화 시스템), 가운 및 두 쌍의 장갑으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜10을 시작하기 전에 PPE를 적절하게 기부하고 도핑하는 기술을 검토하십시오.
- 기증자 사망 후 12-24 시간 이내에 측두골 조직을 수확하십시오. 시체가 냉장 보관되지 않은 경우 사망 후 8 시간 이내에 수확이 이루어 지도록하십시오.
- 네 절개를 사용하여 부검 중에 측두골을 수확, 골골에 의한 차단 방법7.
- 두개골 절제술 후 뇌를 제거하고 두개골 신경을 내부 청각 운하로 급격하게 나눕니다.
- 첫 번째 뼈 절개를 골골과 평행하게하고 측두골의 편평한 부분에 내측으로 만듭니다.
- 두 번째 뼈 절개를 측두골의 내측 경계에서 첫 번째 뼈와 평행하게 수행하십시오.
- 그런 다음 세 번째 절개를 3-4cm 앞쪽으로 만들고 페트로우스 능선과 평행하게하십시오.
- 네 번째 절개를 세 번째 절개와 대략 평행하게, 페트로우스 능선에 2cm 후방으로 만듭니다.
참고: 모든 절개가 두개골 기저부를 통해 확장되는지 확인하십시오. - 그런 다음 날카로운 해부를 사용하여 측두골을 제거하여 시편의 열등한 가장자리를 따라 연조직 부착을 해제하십시오. 측두골 수확 후 방부 처리를 수행해야하는 경우 경동맥의 그루터기를 묶으십시오.
- 네 절개를 사용하여 부검 중에 측두골을 수확, 골골에 의한 차단 방법7.
2. 조직 고정, 탈석회화 및 단면화
- 즉시 조직을 200-300 mL의 10% 완충된 포르말린(formaldehyde)에 넣어 조직이 완전히 침수되도록 한다. 실온에서 최소 72 시간 동안 조직을 포름 알데히드에 넣고 매일 용액을 바꿉니다. 조직을 밀폐 용기에 보관하고 흄 후드 아래에서 용액 변경을 수행하면서 바이러스 확산을 방지하기 위해 적절한 PPE를 착용하십시오.
참고 : 72 시간 고정 기간이 지나면 표본은 더 이상 전염성이있는 것으로 간주 될 필요가 없습니다. - 트윈 다이아몬드 블레이드가 달린 정밀 마이크로 톱을 사용하여 각 시편을 세 개의 "두꺼운"섹션으로 절단하여보다 빠른 조직 탈석회화를 가능하게하십시오. 트윈 다이아몬드 블레이드를 5mm 거리로 설정하여 측두골의 중앙 부분이 5mm 두께가 되도록 합니다. 양쪽 끝에있는 조직 부분이 3-5mm 두께인지 확인하십시오.
- 두꺼운 절편을 23% w/w 포름산 탈석회화 용액 200-300mL에 넣고 조직이 파라핀 임베딩을 위해 충분히 부드러워질 때까지 실온에서 7-10일 동안 놓습니다. 매일 솔루션을 변경하십시오. 부드럽게 느껴질 수있는 표본을 촉지하여 적절한 조직 탈석회화를 확인하십시오.
참고: 탈석회화는 엑스레이로 확인할 수도 있습니다. - 흐르는 수도꼭지 아래의 큰 비커에 넣어 24 시간 동안 수돗물을 헹구십시오.
- 증가 농도의 일련의 알코올에서 조직을 탈수7. 조직을 1.5 시간 동안 70% 에탄올 100-200 mL에 담그고, 각각 1.5 h 동안 95% 및 100% 에탄올로 세 번 세척하였다. 다음에, 조직을 자일렌으로 3 x 1.5 h 세척한다.
- 두꺼운 부분을 파라핀에 넣고 각각 45 분의 네 가지 치료법을 사용합니다.
- 냉동 장치를 사용하여 얇은 (10 μm) 섹션을 절단하십시오. 조직이 축 평면에서 절단되도록 조직을 배치합니다. 원하는 경우 더 두껍게(20μm) 섹션을 잘라냅니다.
3. 면역조직화학 및 영상화
- 전통적인 헤마톡실린 및 에오신 염색이 바람직한 경우(여기에 기재되지 않음), 절편을 유리 슬라이드(7)에 장착하기 전에 염색을 수행한다.
- 양전하를 띤 유리 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
- 슬라이드를 60°C에서 20분 동안 핫플레이트 상에 굽는다.
- 슬라이드를 홀더에 넣고 유기 용매 (이 경우 디에탄올 아민)와 에탄올을 함유 한 상업용 전처리 용액에 담그고 파라핀화, 재 수화 및 조직 마스크를 해제하십시오.
참고: 이 단계는 포르말린 고정 및 파라핀 포매 조직에 대한 면역조직화학으로 만족스러운 결과를 얻기 위해 필요합니다. - 고압의 압력 밥솥에서 슬라이드를 20 분 동안 가열하십시오.
- 슬라이드를 가습 챔버에 놓고 상업용 차단 용액으로 조직을 차단하십시오.
- 조직 절편을 안지오텐신 전환 효소 2 (ACE2; 1:50), 막횡단 프로테아제 세린 2 (TMPRSS2, 1:1,000), 및 퓨린 프로테아제 (1:250)에 대한 1차 항체로 조사한다.
참고: ACE2, TMPRSS2 및 Furin 항체는 이들 단백질이 SARS-CoV-2 감염성11,12에서 역할을 하는 것으로 여겨지기 때문에 사용되며, 이 프로토콜은 SARS-CoV-2가 중이(13)를 감염시킬 수 있는 가능한 메커니즘을 조사하고자 하기 때문이다. - HRP 접합된 항토끼 2차 항체(ACE2, Furin; 1:100 희석) 또는 항-염소(TMPRSS2, 1:100 희석) 2차 항체로 치료한다.
- 물에 70 % 헤마톡실린으로 슬라이드를 얼룩지게하십시오.
- 장착된 디지털 카메라로 광학 현미경으로 이미지를 캡처합니다. 중이 점막과 유스타키오 관의 이미지를 각각 20x 및 10x 배율로 얻습니다.
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Representative Results
중이 점막 및 유스타키오관의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 처리 후 중이 점막 및 중이 조직의 보존을 나타내었다(도 1). 면역조직화학 이미지는 중이 점막 및 유스타키오관 내에서 ACE2, TMPRSS2, 및 퓨린 단백질의 발현을 보여주었다(도 1). 중이 내에 이러한 단백질의 존재는 SARS-CoV-2가 중이 내의 호흡기 상피를 감염시킬 수있는 가능한 경로를 제공합니다11,12,13. 또한, 유스타키오관 내에서 이러한 단백질의 발현은 바이러스가 중이에 들어가고, 유스타키오관을 통해 비인두로부터 중이로 이동하는 경로를 설명할 수 있다.
도 1: 염색된 중이 조직의 예. 그림은 헤마톡실린 및 에오신, ACE2, TMPRSS2 및 중이 점막(윗줄, 20x 배율) 및 유스타키오관(하단 행, 10x 배율)의 푸린 염색을 보여준다. 스케일 바 = 50 μm (상단 행); 100 μm (하단 행). 약어: H&E = 헤마톡실린과 에오신; 안지오텐신-전환 효소 2; TMPRSS2 = 막횡단 프로테아제, 세린 2. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간의 측두골 연구는 내과 중이 병리학을 연구하는 데 중요하지만 시간과 자원 집약적 인 노력으로 남아 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 추가 절편화 전에 신속하게 탈석회화 할 수있는 두꺼운 측두골 절편을 생성하여 조직 수확에서 연구까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축 할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 측두골 처리에 필요한 자원을 줄이고 COVID-19 중이 및 내이 병리학(13)과 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있으며,이 프로토콜을 개발하기위한 동기였습니다. 이 프로토콜은 중이 및 유스타키오 관 내에서 ACE2, TMPRS22 및 Furin 발현의 시각화를 허용하여 SARS-CoV-2가 비인두에서 유스타키오 관을 통해 확산되어 중이를 감염시킬 수있는 메커니즘을 제공했습니다.
이 프로토콜의 주요 혁신은 탈석회화 전에 조직을 절단하는 다이아몬드 톱의 사용이며, 이는 탈석회화제에 노출 된 조직의 표면적을 증가시킴으로써 빠르게 탈석회화 될 수있는 측두골의 "두꺼운"섹션을 생성합니다. 이 단계는 전통적인 프로토콜이 탈석회화를 위해 요구할 수있는 1-2 개월 대신 7-10 일 이내에 조직 탈석회화가 발생할 수있게합니다. 다이아몬드 톱으로 생성 된 조직의 "두꺼운"섹션은 또한 측두골 조직의 표준 블록보다 더 빨리 탈수 될 수 있으므로 탈석회화와 임베딩 사이의 시간이 단축됩니다. 또한,이 프로토콜은 셀로이드 (celloidin)가 아닌 임베딩제로서 파라핀을 사용하며, 이는경화 7에 약 3 개월이 걸립니다. 셀로이드는 달팽이관 구조의 우수한 보존을 제공하는 반면, 파라핀은 훨씬 더 빨리 경화되고 면역 염색을 용이하게합니다. 이러한 변형을 통해 측두골 조직은 전통적인 처리 전략 7,9에서 필요한 9-10 개월과는 달리 10-14 일 내에 처리 될 수 있습니다.
이 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 임베딩하기 전에 다이아몬드 톱으로 조직을 절단하면 Corti (OOC)의 장기가 손상 될 위험이 있습니다. OOC는이 기술을 개발하는 동안 대부분의 표본에서 심각하게 손상되었으며, 이는 내이의 섬세한 구조가 보존되는 것이 중요한 연령 관련 청력 손실과 같은 병리학을 연구하는이 기술의 가치를 제한 할 수 있습니다. 다이아몬드 톱이 오틱 캡슐 뼈를 직접 자르지 않고 내이 구조를 보존하지 않도록 표본을 배치 할 수 있지만 이는 적극적인 조사 영역으로 남아 있습니다. 동물 모델은이 프로토콜을 더욱 정교하게하고 이러한 귀중한 인간 표본에서 내이 구조를 보존 할 가능성을 높이는 데 유용한 도구를 제공 할 수 있습니다. 이 프로토콜에서의 조직 품질은 파라핀 포매제의 사용에 의해 추가로 제한되며, 이는 시간 제약으로 인해 선택되었다. 셀로이드 임베딩은 이비병리학적 표본에서 세포 완전성을 더 잘 유지하지만 경화시키는 데 수개월이 걸립니다7. 마지막으로,이 프로토콜은 여전히 상당한 시간과 자원 투자가 필요합니다. 다이아몬드 마이크로 소의 사용은 전통적인 측두골 준비에 필요한 재료에 대한 추가 비용이며, 탈석회화에 필요한 7-10 일은 여전히 길다. 앞으로, 이러한 방법들을 마이크로파 보조 탈석회화(14 )와 결합하여 처리에 필요한 시간을 더욱 단축시킬 수 있다.
한계에도 불구하고, 여기에 설명 된 고속 측두골 처리를위한 프로토콜은 중이 및 잠재적으로 내이, 병리학을 연구하기위한 또 다른 도구를 제공합니다. 이 기술은 COVID-19 전염병 기간 동안 유용했으며 조직 처리에 필요한 시간과 노동력을 줄임으로써 활성 측두골 실험실을 유지하는 것과 관련된 비용을 줄일 수도 있습니다. 측두골 연구는 미국 내에서 인기가 감소하여 1980 년대 28 개의 활성 실험실에서 현재 4 개의 활성 실험실로 감소했습니다. 수술용 측두골 실험실의 수의 이러한 감소는 측두골 수확 및 가공과 관련된 상당한 비용(4,8)과 관련될 수 있다. 결과적으로, 우리는 측두골 처리에 필요한 자원을 줄이는 기술과 COVID-19 전염병과 같은 새로운 맥락에서 측두골 병리학을 연구 할 수있는 기술을 개발하는 것을 목표로하는 것이 중요합니다. 또한, 이 프로토콜에 요약된 것과 같은 고속 조직 처리는 분자 수준 15,16,17,18,19에서 중이 및 내이 병리학의 평가를 허용하는 새로운 생물학적 기술(예를 들어, 면역조직화학, 전사체학)의 사용을 보조할 수 있다. . 우리는 이비인후과 질환에서 인간 조직을 연구하기 위해 분자 기술을 활용하는 측면에서 표면을 간신히 긁어 냈으며 동물 모델에서 제공 할 수없는 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 도움을 주신 모하메드 리하르에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (T32DC000027, NSA)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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