Højhastigheds human temporal knoglesektionering til vurdering af COVID-19-associeret mellemørepatologi
Summary
Denne artikel beskriver en teknik til hurtig human temporal knoglesektionering, der anvender en mikrosav med to diamantklinger til at generere tynde skiver til hurtig afkalkning og analyse af temporal knogleimmunosistokemi.
Abstract
Histopatologisk analyse af humane temporale knoglesektioner er en grundlæggende teknik til undersøgelse af indre og mellemørepatologi. Temporale knoglesektioner fremstilles ved postmortem temporal knoglehøst, fiksering, afkalkning, indlejring og farvning. På grund af tætheden af den tidlige knogle er afkalkning en tidskrævende og ressourceintensiv proces; komplet vævsforberedelse kan tage 9-10 måneder i gennemsnit. Dette bremser otopatologisk forskning og hindrer tidsfølsomme undersøgelser, såsom dem, der er relevante for COVID-19-pandemien. Dette papir beskriver en teknik til hurtig forberedelse og afkalkning af temporale knoglesektioner for at fremskynde vævsbehandling.
Temporale knogler blev høstet postmortem ved hjælp af standardteknikker og fastgjort i 10% formalin. En præcisionsmikrosav med to diamantklinger blev brugt til at skære hver sektion i tre tykke sektioner. Tykke temporale knoglesektioner blev derefter afkalket i afkalkningsopløsning i 7-10 dage, før de blev indlejret i paraffin, sektioneret i tynde (10 μm) sektioner ved hjælp af et kryotom og monteret på uladede dias. Vævsprøver blev derefter deparaffiniseret og rehydreret til antistoffarvning (ACE2, TMPRSS2, Furin) og afbildet. Denne teknik reducerede tiden fra høst til vævsanalyse fra 9-10 måneder til 10-14 dage. Højhastigheds temporal knoglesektionering kan øge hastigheden af otopatologisk forskning og reducere de ressourcer, der er nødvendige til vævsforberedelse, samtidig med at det letter tidsfølsomme undersøgelser som dem, der er relateret til COVID-19.
Introduction
Human temporal knogleforskning giver en uvurderlig ressource til at studere patologi og patofysiologi i det indre øre og mellemøret. Før det 19. århundrede var der lidt kendt om otologisk sygdom 1,2,3. For bedre at forstå otologisk sygdom og “redde lydkirurgi fra kvaksalverens hænder” udviklede Joseph Toynbee (1815-1866) metoder til at studere histologiske sektioner af den menneskelige temporale knogle3. Dette arbejde blev fremmet af Adam Politzer (1835-1920) i Wien og andre over hele Europa i resten af det 19. århundrede, der brugte tidsmæssige knoglesektioner til at beskrive histopatologien af mange almindelige tilstande, der påvirker øret 2,3,4.
Det første menneskelige temporale knoglelaboratorium i USA blev åbnet i 1927 på Johns Hopkins Hospital, hvor Stacy Guild (1890-1966) udviklede metoder til temporal knoglesektion 5,6. Metoderne udviklet af Guild bestod af en 9-10 måneders proces, der omfattede postmortem høst, fiksering, afkalkning i salpetersyre, dehydrering i ethanol, celloidinindlejring, sektionering, farvning og montering. Ændringer af denne teknik blev senere foretaget af Harold Schuknecht (1917-1996)7; de grundlæggende komponenter i denne proces forbliver dog stort set uændrede.
De betydelige ressourcer, der kræves for at opretholde et temporalt knoglelaboratorium, har udgjort en udfordring for temporal knogleforskning og sandsynligvis bidraget til dens faldende popularitet i løbet af de sidste 30 år 4,8. En betydelig del af temporale knoglelaboratorieressourcer skal afsættes til 9-10 måneders proces med temporal knogleforberedelse. Et af de mest tidskrævende trin i forberedelsen er afkalkningen af den tidlige knogle, som er den tætteste knogle i menneskekroppen. Afkalkning udføres typisk i salpetersyre eller ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og tager uger til måneder, mens det kræver hyppig skift af opløsninger 7,9. Desuden kan tidsfølsomme undersøgelser af det menneskelige øre, såsom dem, der er relateret til COVID-19-pandemien, hindres af denne langsomme forberedelsesproces. Dette papir beskriver en teknik til højhastigheds temporal knoglesektion, der bruger en diamantmikrosav til at generere tykke sektioner, der muliggør hurtig afkalkning og vævsanalyse inden for 10-14 dage efter temporal knoglehøst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Human temporal knogleforskning er afgørende for at studere indre og mellemørepatologi, men forbliver en tids- og ressourceintensiv indsats. Dette papir beskriver en teknik, der bruger en diamantmikrosav til at generere tykke temporale knoglesektioner, der hurtigt kan afkalkes inden yderligere sektionering, så tiden fra vævshøst til undersøgelse kan reduceres fra 9-10 måneder til 10-14 dage. Denne teknik kan reducere de ressourcer, der kræves til temporal knoglebehandling og lette tidsfølsomme undersøgelser, så…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Mohamed Lehar for hans hjælp med dette projekt. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet – 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. . Pathology of the Ear. , (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science–and art–of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. . Pathology of the Ear and Temporal Bone. , (1993).
- . COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE) Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022)
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology – Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
- Wu, P. Z., O’Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
