التحقيق في دوافع مكافحة المكافأة في سلوك الإدمان باستخدام طرق التعبير الجيني أحادي الخلية المحددة تشريحيا
Summary
يوفر الجمع بين التشريح المجهري لالتقاط الليزر و RT-qPCR الموائع الدقيقة خصوصية تشريحية وتقنية حيوية في قياس النسخ في الخلايا العصبية المفردة والدبقية. قد يؤدي تطبيق الأساليب الإبداعية مع نهج بيولوجيا النظام للأمراض النفسية إلى اختراقات في الفهم والعلاج مثل فرضية الالتهاب العصبي المضادة للمكافأة في الإدمان.
Abstract
حفزت المعدلات المتزايدة لسلوك الإدمان الباحثين في مجال الصحة العقلية والأطباء على حد سواء على فهم مكافحة المكافأة والتعافي. هذا التحول بعيدا عن المكافأة والبدء يتطلب وجهات نظر ونماذج وفرضيات جديدة جنبا إلى جنب مع توسيع الأساليب المطبقة للتحقيق في الإدمان. هنا ، نقدم مثالا: نهج بيولوجيا الأنظمة للتحقيق في المكافأة المضادة التي تجمع بين التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) وتفاعلات سلسلة البوليميراز الكمية عالية الإنتاجية للنسخ العكسي للميكروفلويد (RT-qPCR). تم قياس ديناميكيات شبكة التعبير الجيني وتم تحديد المحرك الرئيسي لخلل التنظيم العصبي الحشوي في انسحاب الكحول والمواد الأفيونية ، التهاب الأعصاب. يوفر هذا المزيج من التقنيات خصوصية تشريحية ومظهرية بدقة خلية واحدة مع حساسية عالية الإنتاجية ومقاييس تعبير جيني محددة تسفر عن مجموعات بيانات مولدة للفرضيات وإمكانيات ميكانيكية تولد فرصا لرؤى وعلاجات جديدة.
Introduction
لا يزال الإدمان يمثل تحديا متزايدا في العالم المتقدم 1,2. على الرغم من التقدم العلمي والسريري الكبير ، تستمر معدلات الإدمان في الزيادة بينما تظل فعالية العلاجات المعمول بها مستقرة في أحسن الأحوال3،4،5. ومع ذلك ، فقد أدى التقدم في التكنولوجيا الحيوية والنهج العلمية إلى طرق وفرضيات جديدة لمزيد من التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية للاعتماد على المواد6،7،8. في الواقع ، تشير التطورات الأخيرة إلى أن المفاهيم الجديدة ونماذج العلاج قد تؤدي إلى اختراقات ذات عواقب اجتماعية واقتصادية وسياسية9،10،11،12.
لقد حققنا في مكافحة المكافأة في سحب الكحول والاعتماد على المواد الأفيونية13،14،15،16. الأساليب أساسية لهذا النموذج17,18. يمكن للتشريح المجهري للالتقاط بالليزر (LCM) اختيار خلايا مفردة ذات خصوصية تشريحية عالية. هذه الوظيفة جزء لا يتجزأ من فرضية antireward للالتهاب العصبي حيث يمكن جمع وتحليل كل من الخلايا الدبقية والخلايا العصبية من نفس النواة العصبية في نفس الحيوان13،14،15،16،19. يمكن بعد ذلك قياس جزء ذي صلة من نسخ الخلايا المختارة باستخدام تفاعلات البوليميراز الكمية عالية الإنتاجية (RT-qPCR) التي توفر مجموعات بيانات عالية الأبعاد للتحليل الحسابي مما يؤدي إلى رؤى حول الشبكات الوظيفية20،21.
يؤدي قياس مجموعة فرعية من النسخ في الخلايا العصبية والدبقية في نواة دماغية معينة إلى إنشاء مجموعة بيانات قوية في كل من عدد العينات والجينات المقاسة وهي حساسة ومحددة. هذه الأدوات هي الأمثل لنهج علم الأعصاب في النظام للأمراض النفسية لأن الخلايا الدبقية ، وخاصة الخلايا النجمية والدبقية الصغيرة ، أظهرت دورا مركزيا في الأمراض العصبية والنفسية على مدى العقد الماضي22,23. يمكن لنهجنا قياس الاستجابة التعبيرية للخلايا الدبقية والخلايا العصبية بشكل متزامن عبر العديد من المستقبلات والروابط المشاركة في إشارات paracrine المحلية. في الواقع ، يمكن استنتاج الإشارات من مجموعات البيانات هذه باستخدام طرق كمية مختلفة مثل المنطق الضبابي24. علاوة على ذلك ، يمكن أن يوفر تحديد الأنماط الفرعية الخلوية في الخلايا العصبية أو الدبقية ووظيفتها نظرة ثاقبة حول كيفية تنظيم خلايا الدماغ في نوى معينة والاستجابة لها واختلالها على مستوى الخلية الواحدة. يمكن أيضا نمذجة ديناميكيات هذا النظام الوظيفي باستخدام تجارب السلاسل الزمنية16. أخيرا ، يمكن إزعاج النماذج الحيوانية تشريحيا أو دوائيا لإضفاء حالة ميكانيكية على نهج هذا النظام.
تجربة تمثيلية:
أدناه ، نقدم مثالا على تطبيق هذه الأساليب. بحثت هذه الدراسة في التعبير الجيني للخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في النواة الانفرادية (NTS) استجابة لإدمان الكحول والانسحاب اللاحق16. تتألف مجموعات الفئران من 1) التحكم ، 2) المعتمد على الإيثانول (EtOH) ، 3) سحب 8 ساعات (Wd) ، 4) 32 ساعة Wd ، و 5) 176 ساعة Wd (الشكل 1 أ). بعد قطع الرأس السريع ، تم فصل سيقان الدماغ عن الدماغ الأمامي وتشريحها بالتبريد ، وتم تلطيخ الشرائح للخلايا العصبية الإيجابية للتيروزين هيدروكسيلاز (TH +) والخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1 ب). تم استخدام LCM لجمع كل من TH + و TH- الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة. كانت جميع الخلايا من NTS وتم تحليلها كعينات من تجمعات 10 خلايا. تم تشغيل أربع صفائف ديناميكية RT-qPCR 96 × 96 على منصة RT-qPCR بقياس 65 جينا (الشكل 1B-C). تمت تسوية البيانات باستخدام طريقة -ΔΔCt وتحليلها باستخدام R ، وتم التحقق من صحة اختيار الخلية الواحدة باستخدام العلامات الجزيئية (الشكل 1D-E). تم التحقق من التحقق الفني بشكل أكبر من خلال النسخ المتماثلة التقنية التي تم تحليلها داخل دفعة واحدة وعبر الدفعات (الشكل 2 والشكل 3). تم تنظيم الخلايا العصبية TH + و TH في أنماط ظاهرية فرعية مختلفة مع مجموعات جينية التهابية متشابهة ولكنها تختلف عن مجموعات مستقبلات حمض γ-aminobutyric (GABA) (R) (الشكل 4 والشكل 5). كانت الأنماط الظاهرية الفرعية التي كان لها تعبير مرتفع عن مجموعات الجينات الالتهابية ممثلة تمثيلا زائدا عند 32 ساعة Wd بينما ظل تعبير مستقبلات GABA (GABAR) منخفضا في انسحاب الكحول المطول (176 ساعة Wd). يساهم هذا العمل في فرضية مكافحة المكافأة للاعتماد على الكحول والمواد الأفيونية التي تخمن أن ردود الفعل الاعتراضية من الأحشاء في الانسحاب تساهم في عدم تنظيم النوى العصبية الحشوية والعاطفية (أي NTS واللوزة) مما يؤدي إلى عقابيل أكثر حدة لا إرادية وعاطفية ، والتي تساهم في الاعتماد على المواد (الشكل 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
لا يزال اضطراب تعاطي الكحول مرضا صعبا للعلاج. تعاملت مجموعتنا مع هذا الاضطراب من خلال التحقيق في العمليات المضادة للمكافأة من منظور علم الأعصاب للأنظمة. قمنا بقياس تغيرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية NTS المفردة والخلايا الدبقية الصغيرة في سلسلة زمنية لانسحاب الكحول16. ت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل العمل المقدم هنا من خلال NIH HLB U01 HL133360 الممنوحة ل JS و RV ، NIDA R21 DA036372 الممنوحة ل JS و EVB ، T32 AA-007463 الممنوحة ل Jan Hoek لدعم SJO’S ، والمعهد الوطني لإدمان الكحول وتعاطي الكحول: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
