חקירת מניעים של אנטי-פרסורה בהתנהגות התמכרות באמצעות שיטות ביטוי גנים חד-תאיות ספציפיות אנטומית
Summary
השילוב של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר ו-RT-qPCR מיקרופלואידי מספק ספציפיות אנטומית וביוטכנית במדידת השעתוק בתאי עצב בודדים ובגליה. יישום שיטות יצירתיות עם הגישה הביולוגית של המערכת למחלות פסיכיאטריות עשוי להוביל לפריצות דרך בהבנה ובטיפול כגון השערת נוגד התגמול של דלקת עצבית בהתמכרות.
Abstract
שיעורים הולכים וגדלים של התנהגות התמכרות הניעו חוקרים בתחום בריאות הנפש וקלינאים כאחד להבין את ההתמכרות וההחלמה. התרחקות זו מתגמול ומהתחלה מחייבת נקודות מבט חדשות, פרדיגמות והשערות יחד עם הרחבת השיטות המיושמות לחקר התמכרות. כאן אנו מספקים דוגמה: גישה ביולוגית מערכתית לחקר אנטי-פרסיה המשלבת מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) ותגובות שרשרת פולימראז כמותיות של שעתוק מיקרופלואידי בתפוקה גבוהה (RT-qPCR). דינמיקה של רשת ביטוי גנים נמדדה וזוהה גורם מפתח לדיסרגולציה נוירו-ויסצרלית בגמילה מאלכוהול ואופיואידים, דלקת עצבית. שילוב זה של טכנולוגיות מספק ספציפיות אנטומית ופנוטיפית ברזולוציה של תא בודד עם רגישות לתפוקה גבוהה ומדדי ביטוי גנים ספציפיים המניבים הן מערכי נתונים מחוללי השערות והן אפשרויות מכניסטיות המייצרות הזדמנויות לתובנות וטיפולים חדשניים.
Introduction
התמכרות נותרה אתגר הולך וגדל בעולם המפותח 1,2. למרות ההתקדמות המדעית והקלינית הגדולה, שיעורי ההתמכרות ממשיכים לעלות בעוד היעילות של טיפולים מבוססים נשארת יציבה במקרה הטוב 3,4,5. עם זאת, ההתקדמות בביוטכנולוגיה ובגישות מדעיות הובילה לשיטות והשערות חדשניות כדי לחקור עוד יותר את הפתופיזיולוגיה של התלות בחומרים 6,7,8. ואכן, ההתפתחויות האחרונות מצביעות על כך שמושגים חדשים ופרדיגמות טיפוליות עשויים להוביל לפריצות דרך בעלות השלכות חברתיות, כלכליות ופוליטיות 9,10,11,12.
חקרנו את האנטי-פרסה בגמילה מאלכוהול ותלות באופיואידים13,14,15,16. השיטות הן מרכזיות בפרדיגמה זו17,18. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) יכולה לבחור תאים בודדים עם ספציפיות אנטומית גבוהה. פונקציונליות זו היא חלק בלתי נפרד מהשערת האנטי-פרסה של דלקת עצבית, שכן ניתן לאסוף ולנתח גם גליה וגם נוירונים מאותו תת-גרעין עצבי באותה חיה 13,14,15,16,19. לאחר מכן ניתן למדוד חלק רלוונטי של תעתיק של תאים נבחרים באמצעות תגובות שרשרת פולימראז כמותיות של שעתוק מיקרופלואידי בתפוקה גבוהה (RT-qPCR) המספקות מערכי נתונים בממדים גבוהים לניתוח חישובי המניבים תובנות על רשתות פונקציונליות20,21.
מדידת תת-קבוצה של תעתיק בתאי עצב וגליה בגרעין מוח מסוים מייצרת מערך נתונים חזק הן במספר הדגימה והן בגנים שנמדדו והוא רגיש וספציפי. כלים אלה הם אופטימליים לגישת מדעי המוח של המערכת למחלות פסיכיאטריות מכיוון שגליה, בעיקר אסטרוציטים ומיקרוגליה, הדגימו תפקיד מרכזי במחלות נוירולוגיות ופסיכיאטריות בעשור האחרון22,23. הגישה שלנו יכולה למדוד את התגובה האקספרסיבית של גליה ותאי עצב במקביל על פני קולטנים וליגנדים רבים המעורבים באיתות פרקריני מקומי. ואכן, ניתן להסיק איתות ממערכי נתונים אלה באמצעות שיטות כמותיות שונות כגון לוגיקה מטושטשת24. יתר על כן, זיהוי תת-פנוטיפים תאיים בתאי עצב או בגליה ותפקודם יכולים לספק תובנה לגבי האופן שבו תאי מוח בגרעינים מסוימים מתארגנים, מגיבים ומווסתים דיסרגולציה ברמת התא הבודד. ניתן למדל את הדינמיקה של מערכת פונקציונלית זו גם באמצעות ניסויי סדרות זמן16. לבסוף, מודלים של בעלי חיים יכולים להיות מעוותים מבחינה אנטומית או פרמקולוגית כדי לתת תנאי מכניסטי לגישה של מערכת זו.
ניסוי מייצג:
להלן, אנו מספקים דוגמה ליישום של שיטות אלה. מחקר זה בחן את ביטוי הגנים העצביים והמיקרוגליה של חולדות בגרעין הבודד (NTS) בתגובה לתלות באלכוהול ולגמילה16 לאחר מכן. קבוצות חולדות כללו 1) שליטה, 2) תלוי אתנול (EtOH), 3) 8 שעות נסיגה (Wd), 4) 32 שעות Wd, ו-5) 176 h Wd (איור 1A). לאחר עריפה מהירה, גזעי המוח הופרדו מהמוח הקדמי והוקפאו, ופרוסות הוכתמו עבור נוירונים חיוביים לטירוזין הידרוקסילאז (TH +) ומיקרוגליה (איור 1B). LCM שימש לאיסוף תאי עצב TH+ ו-TH ומיקרוגליה. כל התאים היו מה-NTS ונותחו כדגימות של מאגרי 10 תאים. ארבעה מערכים דינמיים של 96 x 96 מיקרופלואידיים RT-qPCR הופעלו על פלטפורמת RT-qPCR שמדדה 65 גנים (איור 1B-C). הנתונים נורמלו בשיטתt -ΔΔC ונותחו באמצעות R, ובחירת תאים בודדים אומתה באמצעות סמנים מולקולריים (איור 1D-E). האימות הטכני אומת עוד יותר על-ידי משכפלים טכניים שנותחו בתוך אצווה אחת ועל פני אצוות (איור 2 ואיור 3). תאי עצב TH+ ו-TH מאורגנים בתת-פנוטיפים שונים עם אשכולות גנים דלקתיים דומים, אך אשכולות קולטן (R) של חומצה γ-אמינו-בוטירית (GABA) שונים (איור 4 ואיור 5). תת-פנוטיפים שהיו בעלי ביטוי מוגבר של אשכולות גנים דלקתיים היו מיוצגים יתר על המידה ב-32 שעות Wd ואילו ביטוי קולטן GABA (GABAR) נותר נמוך בגמילה ממושכת מאלכוהול (176 שעות Wd). עבודה זו תורמת להשערה האנטי-פרסית של תלות באלכוהול ובאופיואידים, אשר משערת כי משוב מיירט מהקרביים בגמילה תורם לדיסרגולציה של גרעינים עצביים קרביים-רגשיים (כלומר, NTS ואמיגדלה) וכתוצאה מכך להמשך אוטונומי ורגשי חמור יותר, התורם לתלות בחומרים (איור 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרעת שימוש באלכוהול נותרה מחלה מאתגרת לטיפול. הקבוצה שלנו ניגשה להפרעה זו על ידי חקירת תהליכים אנטי-פרסואליים עם נקודת מבט של מדעי המוח המערכתיים. מדדנו שינויים בביטוי גנים בתאי עצב בודדים מסוג NTS ובמיקרוגליה בסדרת זמן גמילה מאלכוהול16. ה- NTS נבחר בשל תפקידו הבולט בדיסרגולציה …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המוצגת כאן מומנה באמצעות NIH HLB U01 HL133360 שהוענק ל- JS ו- RV, NIDA R21 DA036372 שהוענק ל- JS ו- EVB, T32 AA-007463 הוענק ליאן הוק לתמיכה ב- SJO’S, והמכון הלאומי לאלכוהוליזם והתמכרות לאלכוהול: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
