Untersuchung von Treibern von Anti-Belohnung im Suchtverhalten mit anatomisch spezifischen Einzelzell-Genexpressionsmethoden
Summary
Die Kombination von Laser-Capture-Mikrodissektion und mikrofluidischer RT-qPCR bietet anatomische und biotechnische Spezifität bei der Messung des Transkriptoms in einzelnen Neuronen und Glia. Die Anwendung kreativer Methoden mit dem systembiologischen Ansatz auf psychiatrische Erkrankungen kann zu Durchbrüchen im Verständnis und in der Behandlung führen, wie z.B. die Neuroinflammation-Anti-Belohnungs-Hypothese bei Sucht.
Abstract
Steigende Raten von Suchtverhalten haben Forscher für psychische Gesundheit und Kliniker gleichermaßen motiviert, Antibelohnung und Genesung zu verstehen. Diese Abkehr von Belohnung und Beginn erfordert neue Perspektiven, Paradigmen und Hypothesen sowie eine Erweiterung der Methoden zur Untersuchung von Sucht. Hier geben wir ein Beispiel: Ein systembiologischer Ansatz zur Untersuchung von Antibelohnung, der Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) und Hochdurchsatz-Mikrofluidik-Reverse-Transkriptions-quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) kombiniert. Die Netzwerkdynamik der Genexpression wurde gemessen und ein Schlüsselfaktor für neuroviszerale Dysregulation beim Alkohol- und Opioidentzug, die Neuroinflammation, identifiziert. Diese Kombination von Technologien bietet anatomische und phänotypische Spezifität bei Einzelzellauflösung mit hoher Durchsatzsensitivität und spezifischen Genexpressionsmessungen, die sowohl hypothesengenerierende Datensätze als auch mechanistische Möglichkeiten liefern, die Möglichkeiten für neue Erkenntnisse und Behandlungen schaffen.
Introduction
Sucht bleibt eine wachsende Herausforderung in den Industrieländern 1,2. Trotz großer wissenschaftlicher und klinischer Fortschritte steigen die Suchtraten weiter an, während die Wirksamkeit etablierter Behandlungen bestenfalls stabil bleibt 3,4,5. Fortschritte in der Biotechnologie und wissenschaftliche Ansätze haben jedoch zu neuen Methoden und Hypothesen geführt, um die Pathophysiologie der Substanzabhängigkeit weiter zu untersuchen 6,7,8. Tatsächlich deuten jüngste Entwicklungen darauf hin, dass neuartige Konzepte und Behandlungsparadigmen zu Durchbrüchen mit sozialen, wirtschaftlichen und politischen Konsequenzen führen können 9,10,11,12.
Wir untersuchten Anti-Belohnung beim Entzug von Alkohol und Opioidabhängigkeit13,14,15,16. Methoden sind zentral für dieses Paradigma17,18. Die Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) kann einzelne Zellen mit hoher anatomischer Spezifität auswählen. Diese Funktionalität ist integraler Bestandteil der Neuroinflammation-Anti-Belohnungshypothese, da sowohl Gliazellen als auch Neuronen aus demselben neuronalen Subnukleus im selben Tier gesammelt und analysiert werden können 13,14,15,16,19. Ein relevanter Teil des Transkriptoms ausgewählter Zellen kann dann mit Hochdurchsatz-mikrofluidischen quantitativen Polymerase-Polymerase-Kettenreaktionen (RT-qPCR) gemessen werden, die hochdimensionale Datensätze für die computergestützte Analyse liefern, die Einblicke in funktionelle Netzwerke liefern20,21.
Die Messung einer Teilmenge des Transkriptoms in Neuronen und Gliazellen in einem bestimmten Hirnkern erzeugt einen Datensatz, der sowohl in Bezug auf die Probenanzahl als auch auf die gemessenen Gene robust und sensitiv und spezifisch ist. Diese Werkzeuge sind optimal für den neurowissenschaftlichen Ansatz eines Systems für psychiatrische Erkrankungen, da Glia, hauptsächlich Astrozyten und Mikroglia, in den letzten zehn Jahren eine zentrale Rolle bei neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen gespielt haben22,23. Unser Ansatz kann die expressive Reaktion von Gliazellen und Neuronen gleichzeitig über zahlreiche Rezeptoren und Liganden messen, die an der lokalen parakrinen Signalübertragung beteiligt sind. Tatsächlich kann die Signalisierung aus diesen Datensätzen mit verschiedenen quantitativen Methoden wie Fuzzy-Logik24 abgeleitet werden. Darüber hinaus kann die Identifizierung zellulärer Subphänotypen in Neuronen oder Gliazellen und ihrer Funktion Aufschluss darüber geben, wie sich Gehirnzellen in bestimmten Kernen auf Einzelzellebene organisieren, darauf reagieren und sie dysregulieren. Die Dynamik dieses Funktionssystems kann auch mit Zeitreihenexperimentenmodelliert werden 16. Schließlich können Tiermodelle anatomisch oder pharmakologisch gestört werden, um dem Ansatz dieses Systems eine mechanistische Bedingung zu verleihen.
Repräsentatives Experiment:
Im Folgenden finden Sie ein Beispiel für die Anwendung dieser Methoden. Diese Studie untersuchte die neuronale und Mikroglia-Genexpression von Ratten im solitären Kern (NTS) als Reaktion auf Alkoholabhängigkeit und anschließenden Entzug16. Rattenkohorten umfassten 1) Kontrolle, 2) Ethanol-abhängig (EtOH), 3) 8-Stunden-Entzug (Wd), 4) 32 Stunden Wd und 5) 176 Stunden Wd (Abbildung 1A). Nach einer schnellen Enthauptung wurden Hirnstängel vom Vorderhirn getrennt und kryosektioniert, und Scheiben wurden für Tyrosinhydroxylase-positive (TH +) Neuronen und Mikroglia gefärbt (Abbildung 1B). LCM wurde verwendet, um sowohl TH+ als auch TH-Neuronen und Mikroglia zu sammeln. Alle Zellen stammten aus dem NTS und wurden als Proben von 10-Zell-Pools analysiert. Vier 96 x 96 mikrofluidische RT-qPCR dynamische Arrays wurden auf der RT-qPCR-Plattform mit 65 Genen durchgeführt (Abbildung 1B-C). Die Daten wurden mit einer -ΔΔC-t-Methode normalisiert und mit R analysiert, und die Einzelzellselektion wurde mit molekularen Markern validiert (Abbildung 1D-E). Die technische Validierung wurde weiter durch technische Replikate überprüft, die innerhalb einer einzelnen Charge und chargenübergreifend analysiert wurden (Abbildung 2 und Abbildung 3). TH+- und TH-Neuronen, die in verschiedenen Subphänotypen mit ähnlichen entzündlichen Genclustern, aber unterschiedlichen γ-Aminobuttersäure (GABA)-Rezeptor-Clustern (R) organisiert sind (Abbildung 4 und Abbildung 5). Subphänotypen, die eine erhöhte Expression von entzündlichen Genclustern aufwiesen, waren bei 32 h Wd überrepräsentiert, während die GABA-Rezeptor (GABAR) -Expression bei langwierigem Alkoholentzug niedrig blieb (176 h Wd). Diese Arbeit trägt zur Anti-Belohnungshypothese der Alkohol- und Opioidabhängigkeit bei, die vermutet, dass interzeptives Feedback von den Eingeweiden beim Entzug zur Dysregulation viszeral-emotionaler neuronaler Kerne (d.h. NTS und Amygdala) beiträgt, was zu schwereren autonomen und emotionalen Folgeerscheinungen führt, die zur Substanzabhängigkeit beitragen (Abbildung 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alkoholkonsumstörung bleibt eine herausfordernde Krankheit zu behandeln. Unsere Gruppe hat sich dieser Störung genähert, indem sie Anti-Belohnungsprozesse aus einer systemneurowissenschaftlichen Perspektive untersucht hat. Wir haben Genexpressionsveränderungen in einzelnen NTS-Neuronen und Mikroglia in einer Alkoholentzugszeitreihe16 gemessen. Das NTS wurde aufgrund seiner herausragenden Rolle bei der autonomen Dysregulation ausgewählt, die beim Alkoholentzugssyndrom auftritt. Wir kombinieren…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die hier vorgestellte Arbeit wurde durch NIH HLB U01 HL133360 für JS und RV, NIDA R21 DA036372 für JS und EVB, T32 AA-007463 für Jan Hoek zur Unterstützung von SJO’S und National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873 finanziert.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
