Undersöka drivkrafter för antireward i beroendebeteende med anatomiskt specifika encelliga genuttrycksmetoder
Summary
Kombinationen av laserfångande mikrodissektion och mikrofluidisk RT-qPCR ger anatomisk och bioteknisk specificitet vid mätning av transkriptomet i enskilda neuroner och glia. Att tillämpa kreativa metoder med ett systems biologiska förhållningssätt till psykiatrisk sjukdom kan leda till genombrott i förståelse och behandling såsom neuroinflammation antireward-hypotesen vid missbruk.
Abstract
Ökande nivåer av missbruksbeteende har motiverat både forskare inom psykisk hälsa och kliniker att förstå antireward och återhämtning. Detta skifte bort från belöning och början kräver nya perspektiv, paradigmer och hypoteser tillsammans med en utvidgning av de metoder som tillämpas för att undersöka missbruk. Här ger vi ett exempel: En systembiologisk metod för att undersöka antireward som kombinerar laserinfångningsmikrodissektion (LCM) och mikrofluidiska kvantitativa transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning. Genuttrycksnätverksdynamik mättes och en viktig drivkraft för neurovisceral dysreglering vid alkohol- och opioidabstinens, neuroinflammation, identifierades. Denna kombination av tekniker ger anatomisk och fenotypisk specificitet vid encellsupplösning med hög genomströmningskänslighet och specifika genuttrycksmått som ger både hypotesgenererande datamängder och mekanistiska möjligheter som genererar möjligheter till nya insikter och behandlingar.
Introduction
Beroende är fortfarande en växande utmaning i den utvecklade världen 1,2. Trots stora vetenskapliga och kliniska framsteg fortsätter beroendegraden att öka medan effekten av etablerade behandlingar förblir stabil i bästa fall 3,4,5. Framsteg inom bioteknik och vetenskapliga tillvägagångssätt har dock lett till nya metoder och hypoteser för att ytterligare undersöka patofysiologin för substansberoende 6,7,8. Den senaste utvecklingen tyder faktiskt på att nya begrepp och behandlingsparadigmer kan leda till genombrott med sociala, ekonomiska och politiska konsekvenser 9,10,11,12.
Vi undersökte antireward vid uttag av alkohol- och opioidberoende13,14,15,16. Metoder är centrala för detta paradigm17,18. Laserfångande mikrodissektion (LCM) kan välja enstaka celler med hög anatomisk specificitet. Denna funktionalitet är integrerad i neuroinflammation antireward-hypotesen eftersom både glia och neuroner kan samlas in och analyseras från samma neuronala subnukleus i samma djur 13,14,15,16,19. En relevant del av transkriptomet för utvalda celler kan sedan mätas med mikrofluidiska omvända transkriptionskvantitativa polymeraskedjereaktioner (RT-qPCR) med hög genomströmning som ger högdimensionella datamängder för beräkningsanalys som ger insikter i funktionella nätverk20,21.
Att mäta en delmängd av transkriptomet i nervceller och glia i en specifik hjärnkärna genererar en dataset som är robust i både provantal och uppmätta gener och är känslig och specifik. Dessa verktyg är optimala för ett systems neurovetenskapliga tillvägagångssätt för psykiatrisk sjukdom eftersom glia, främst astrocyter och microglia, har visat en central roll i neurologisk och psykiatrisk sjukdom under det senaste decenniet22,23. Vårt tillvägagångssätt kan mäta det uttrycksfulla svaret från glia och neuroner samtidigt över många receptorer och ligander som är involverade i lokal parakrin signalering. Faktum är att signalering kan härledas från dessa datamängder med hjälp av olika kvantitativa metoder som fuzzy logic24. Vidare kan identifieringen av cellulära subfenotyper i neuroner eller glia och deras funktion ge insikt i hur hjärnceller i specifika kärnor organiserar, svarar på och dysreglerar på encellsnivå. Dynamiken i detta funktionella system kan också modelleras med tidsserieexperiment16. Slutligen kan djurmodeller störas anatomiskt eller farmakologiskt för att ge ett mekanistiskt tillstånd till detta systems tillvägagångssätt.
Representativt experiment:
Nedan ger vi ett exempel på tillämpningen av dessa metoder. Denna studie undersökte råttneuronala och mikroglia-genuttryck i den ensamma kärnan (NTS) som svar på alkoholberoende och efterföljande tillbakadragande16. Råttkohorter omfattade 1) Kontroll, 2) Etanolberoende (EtOH), 3) 8 h abstinens (Wd), 4) 32 h Wd och 5) 176 h Wd (Figur 1A). Efter snabb halshuggning separerades hjärnstammar från framhjärnan och kryosektionerades, och skivor färgades för tyrosinhydroxylaspositiva (TH +) neuroner och mikroglia (figur 1B). LCM användes för att samla in både TH+ och TH- neuroner och microglia. Alla celler var från NTS och analyserades som prover av 10-cellspooler. Fyra 96 x 96 mikrofluidiska RT-qPCR dynamiska arrays kördes på RT-qPCR-plattformen som mäter 65 gener (figur 1B-C). Data normaliserades med hjälp av en -ΔΔCt-metod och analyserades med R, och encellsval validerades med molekylära markörer (figur 1D-E). Teknisk validering verifierades ytterligare av tekniska replikat som analyserades inom en enda sats och mellan satser (figur 2 och figur 3). TH + och TH- neuroner organiserade i olika subfenotyper med liknande inflammatoriska genkluster men olika γ-aminosmörsyra (GABA) receptor (R) kluster (Figur 4 och Figur 5). Subfenotyper som hade förhöjt uttryck av inflammatoriska genkluster var överrepresenterade vid 32 h Wd medan GABA-receptor (GABAR) uttryck förblev lågt vid långvarig alkoholabstinens (176 h Wd). Detta arbete bidrar till antireward-hypotesen om alkohol- och opioidberoende som antar att avlyssnande återkoppling från inälvorna i abstinens bidrar till dysreglering av visceral-emotionella neuronala kärnor (dvs. NTS och amygdala) vilket resulterar i allvarligare autonoma och känslomässiga följder, vilket bidrar till substansberoende (Figur 6).
Protocol
Representative Results
Discussion
Alkoholanvändningsstörning är fortfarande en utmanande sjukdom att behandla. Vår grupp har närmat sig denna sjukdom genom att undersöka antireward-processer med ett systemneurovetenskapligt perspektiv. Vi mätte genuttrycksförändringar i enstaka NTS-neuroner och mikroglia i en alkoholabstinenstidsserie16. NTS valdes för sin framträdande roll i den autonoma dysreglering som uppstår vid alkoholabstinenssyndrom. Vi kombinerar LCM med encellig mikrofluidisk RT-qPCR vilket möjliggör robust…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet som presenteras här finansierades genom NIH HLB U01 HL133360 som tilldelades JS och RV, NIDA R21 DA036372 tilldelades JS och EVB, T32 AA-007463 tilldelades Jan Hoek till stöd för SJO’S och National Institute of Alcoholism and Alcohol Abuse: R01 AA018873.
Materials
| 20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | NA |
| 2x GE Assay Loading Reagent | Fluidigm | 85000802-R | NA |
| 96.96 Dynamic Array IFC for Gene Expression (referred to as qPCR chip in text) | Fluidigm | BMK-M-96.96 | NA |
| Anti-Cd11β Antibody | Genway Biotech | CCEC48 | Microglia Stain |
| Anti-NeuN Antibody, clone A60 | EMD Millipore | MAB377 | Neuronal Stain |
| Anti-tyrosine hydroxylase antibody | abcam | ab112 | Stain for TH+ neurons |
| ArcturusXT Laser Capture Microdissection System | Arcturus | NA | NA |
| Biomark HD | Fluidigm | NA | RT-qPCR platform |
| Bovine Serum Antigen | Sigma-Aldrich | B4287 | |
| CapSure Macro LCM Caps | ThermoFisher Scientific | LCM0211 | NA |
| CellDirect One-Step qRT-PCR Kit | ThermoFisher Scientific | 11753500 | Lysis buffer solution components |
| CellsDirect Resuspension & Lysis Buffer Kit | ThermoFisher Scientific | 11739010 | Invitrogen |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | Nucleus Stain |
| DNA Suspension Buffer | TEKnova | T0221 | |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) ReadyProbe Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | R37118 | Seconadry Antibody |
| Exonuclease I | New Englnad BioLabs, Inc. | M0293S | NA |
| ExtracSure Sample Extraction Device | ThermoFisher Scientific | LCM0208 | NA |
| FisherbrandTM Superfrost Plus Microscope Slides | ThermoFisher Scientific | 22-037-246 | Plain glass slides |
| GeneAmp Thin-Walled Reaction Tube | ThermoFisher Scientific | N8010611 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Superclona Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A28180 | Seconadry Antibody |
| IFC Controller | Fluidigm | NA | NA |
| RNaseOut | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox | Bio-Rad | PN 172-5211 | NA |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | ThermoFisher Scientific | 11754250 | Contains VILO and SuperScript |
| T4 Gene 32 Protein | New Englnad BioLabs, Inc. | M0300S | NA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4391128 | NA |
| TE Buffer | TEKnova | T0225 | NA |
| TempPlate Semi-Skirted 96-Well PCR Plate, 0.2 mL | USA Scientific | 1402-9700 | NA |
References
- . Substance Use and Mental Health Indicators in the United States: Results from the 2019 National Survey on Drug Use and Health Available from: https://www.samhsa.gov/data/ (2020)
- Prevalence of Serious Mental Illness (SMI). NIH Available from: https://www.nimh.nih.gov/health/statistics/mental-illness.shtml (2020)
- Mattick, R. P., Kimber, J., Breen, C., Davoli, M., Mattick, R. P. Buprenorphine maintenance versus placebo or methadone maintenance for opioid dependence. Cochrane Database of Systematic Reviews. , (2008).
- Mattick, R. P., Breen, C., Kimber, J., Davoli, M. Methadone maintenance therapy versus no opioid replacement therapy for opioid dependence. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 2009 (3), (2009).
- Miller, P. M., Book, S. W., Stewart, S. H. Medical treatment of alcohol dependence: A systematic review. International Journal of Psychiatry in Medicine. 42 (3), 227-266 (2012).
- Holmes, E. A., et al. The Lancet Psychiatry Commission on psychological treatments research in tomorrow’s science. The Lancet. Psychiatry. 5 (3), 237-286 (2018).
- Ford, C. L., Young, L. J. Translational opportunities for circuit-based social neuroscience: advancing 21st century psychiatry. Current Opinion in Neurobiology. 68, 1-8 (2021).
- Holmes, E. A., Craske, M. G., Graybiel, A. M. Psychological treatments: A call for mental-health science. Nature. 511 (7509), 287-289 (2014).
- Miranda, A., Taca, A. Neuromodulation with percutaneous electrical nerve field stimulation is associated with reduction in signs and symptoms of opioid withdrawal: a multisite, retrospective assessment. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 44 (1), 56-63 (2018).
- Metz, V. E., et al. Effects of ibudilast on the subjective, reinforcing, and analgesic effects of oxycodone in recently detoxified adults with opioid dependence. Neuropsychopharmacology. 42 (9), 1825-1832 (2017).
- Heinzerling, K. G., et al. placebo-controlled trial of targeting neuroinflammation with ibudilast to treat methamphetamine use disorder. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (2), 238-248 (2020).
- Bogenschutz, M. P., et al. Psilocybin-assisted treatment for alcohol dependence: A proof-of-concept study. Journal of Psychopharmacology. 29 (3), 289-299 (2015).
- O’Sullivan, S. J., Schwaber, J. S. Similarities in alcohol and opioid withdrawal syndromes suggest common negative reinforcement mechanisms involving the interoceptive antireward pathway. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 125, 355-364 (2021).
- O’Sullivan, S. J. Single-cell systems neuroscience: A growing frontier in mental illness. Biocell. 46 (1), 7-11 (2022).
- O’Sullivan, S. J., et al. Single-cell glia and neuron gene expression in the central amygdala in opioid withdrawal suggests inflammation with correlated gut dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665 (2019).
- O’Sullivan, S. J., McIntosh-Clarke, D., Park, J., Vadigepalli, R., Schwaber, J. S. Single cell scale neuronal and glial gene expression and putative cell phenotypes and networks in the nucleus tractus solitarius in an alcohol withdrawal time series. Frontiers in Systems Neuroscience. 15, 739790 (2021).
- O’Sullivan, S. J., Reyes, B. A. S., Vadigepalli, R., Van Bockstaele, E. J., Schwaber, J. S. Combining laser capture microdissection and microfluidic qpcr to analyze transcriptional profiles of single cells: A systems biology approach to opioid dependence. Journal of Visualized Experiments. (157), e60612 (2020).
- Achanta, S., Vadigepalli, R. Single cell high-throughput qRT-PCR protocol. Protocols.io. , (2020).
- O’Sullivan, S. J. The interoceptive antireward pathway and gut dysbiosis in addiction. Journal of Psychiatry, Depression & Anxiety. 7 (40), 1-5 (2021).
- Park, J., et al. Single-cell transcriptional analysis reveals novel neuronal phenotypes and interaction networks involved in the central circadian clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481 (2016).
- Staehle, M. M., et al. Diurnal patterns of gene expression in the dorsal vagal complex and the central nucleus of the amygdala – Non-rhythm-generating brain regions. Frontiers in Neuroscience. 14, 375 (2020).
- Réus, G. Z., et al. The role of inflammation and microglial activation in the pathophysiology of psychiatric disorders. Neuroscience. 300, 141-154 (2015).
- Zhang, X., et al. Role of astrocytes in major neuropsychiatric disorders. Neurochemical Research. 46 (10), 2715-2730 (2021).
- Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (1), 87-98 (2015).
- Lieber, C. S., DeCarli, L. M. An experimental model of alcohol feeding and liver injury in the baboon. Journal of Medical Primatology. 3 (3), 153-163 (1974).
- Lieber, C. S., Decarli, L. M. Animal models of chronic ethanol toxicity. Methods in Enzymology. 233, 585-594 (1994).
- Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24 (6), 930-941 (2014).
- Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (1982).
