Summary

تحضير جسيمات النواة النيوكليوسوم المعقدة مع عوامل إصلاح الحمض النووي للتحديد الهيكلي للمجهر الإلكتروني بالتبريد

Published: August 17, 2022
doi:

Summary

يحدد هذا البروتوكول بالتفصيل تحضير معقدات النيوكليوسومال باستخدام طريقتين لإعداد العينة لتجميد شبكات TEM.

Abstract

إصلاح الحمض النووي في سياق الكروماتين غير مفهوم بشكل جيد. تظهر الدراسات الكيميائية الحيوية التي تستخدم جزيئات النيوكليوسوم الأساسية ، وهي الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين ، أن معظم إنزيمات إصلاح الحمض النووي تزيل تلف الحمض النووي بمعدلات منخفضة مقارنة بالحمض النووي الحر. لم يتم توضيح التفاصيل الجزيئية حول كيفية تعرف إنزيمات إصلاح استئصال القاعدة (BER) على تلف الحمض النووي في النيوكليوسومات وإزالته. ومع ذلك ، تشير بيانات BER البيوكيميائية للركائز النووية إلى أن النيوكليوسوم يقدم حواجز هيكلية مختلفة تعتمد على موقع آفة الحمض النووي والإنزيم. وهذا يشير إلى أن الآليات التي تستخدمها هذه الإنزيمات لإزالة تلف الحمض النووي (DNA) في الحمض النووي الحر قد تختلف عن الآليات المستخدمة في النيوكليوسومات. بالنظر إلى أن غالبية الحمض النووي الجينومي يتم تجميعها في النيوكليوسومات ، فإن المعلومات التركيبية لهذه المركبات مطلوبة. حتى الآن ، يفتقر المجتمع العلمي إلى بروتوكولات مفصلة لإجراء دراسات هيكلية مجدية تقنيا لهذه المجمعات. هنا ، نقدم طريقتين لإعداد مركب من اثنين من إنزيمات BER المنصهرة وراثيا (Polymerase β و AP Endonuclease1) مرتبطة بفجوة نيوكليوتيد واحدة بالقرب من دخول وخروج النيوكليوسوم للمجهر الإلكتروني بالتبريد (cryo-EM) التحديد الهيكلي. كلتا الطريقتين لتحضير العينة متوافقتان مع شبكات جودة التزجيج عن طريق التجميد الغاطس. يمكن استخدام هذا البروتوكول كنقطة انطلاق لإعداد معقدات نووية أخرى بعوامل BER مختلفة ، وعوامل نسخ رائدة ، وإنزيمات معدلة للكروماتين.

Introduction

يتم تنظيم الحمض النووي حقيقي النواة وضغطه بواسطة بروتينات هيستون ، مكونا الكروماتين. يشكل جسيم النواة الأساسي (NCP) الوحدة الأساسية المتكررة للكروماتين التي تنظم إمكانية الوصول إلى البروتينات المرتبطة بالحمض النووي لإصلاح الحمض النووي ونسخه وتكراره1. على الرغم من أن البنية البلورية الأولى للأشعة السينية ل NCP قد تم حلها لأول مرة منذ أكثر من عقدين منالزمن 2 وتم نشر العديد من هياكل NCP منذ3،4،5،6 ، لم يتم بعد تحديد آليات إصلاح الحمض النووي في الركائز النووية. سيتطلب الكشف عن التفاصيل الجزيئية الكامنة وراء إصلاح الحمض النووي في الكروماتين توصيفا هيكليا للمكونات المشاركة لفهم كيفية تنظيم السمات الهيكلية المحلية ل NCP لأنشطة إصلاح الحمض النووي. هذا مهم بشكل خاص في سياق إصلاح استئصال القاعدة (BER) بالنظر إلى أن الدراسات الكيميائية الحيوية مع إنزيمات BER تشير إلى آليات فريدة لإصلاح الحمض النووي في النيوكليوسومات التي تعتمد على المتطلبات الهيكلية الخاصة بالإنزيم للتحفيز والموقع الهيكلي لآفة الحمض النووي داخل النيوكليوسوم7،8،9،10،11،12،13 . بالنظر إلى أن BER هي عملية إصلاح حيوية للحمض النووي ، فهناك اهتمام كبير بسد هذه الفجوات مع إنشاء نقطة انطلاق يمكن من خلالها إجراء دراسات هيكلية أخرى مجدية تقنيا تتضمن مجمعات نيوكليوسومات ذات صلة.

أصبح Cryo-EM بسرعة الطريقة المفضلة لحل البنية ثلاثية الأبعاد (3D) للمجمعات التي يمثل إعدادها على نطاق واسع لعينة متجانسة تحديا. على الرغم من أن تصميم وتنقية NCPs المعقدة بعامل إصلاح الحمض النووي (NCP-DRF) سيتطلب على الأرجح تحسينا مخصصا ، فإن الإجراء المقدم هنا لتوليد وتجميد مجمع NCP-DRF مستقر يوفر تفاصيل حول كيفية تحسين العينة وإعداد شبكة cryo-EM. هناك سير عمل (غير متعارضين) موضحين في الشكل 1 ، والتفاصيل المحددة في البروتوكول تحدد الخطوات الهامة وتوفر استراتيجيات لتحسين هذه الخطوات. سيدفع هذا العمل مجال إصلاح الكروماتين والحمض النووي في اتجاه يصبح فيه استكمال الكيمياء الحيوية بالدراسات الهيكلية ممكنا تقنيا لفهم الآليات الجزيئية لإصلاح الحمض النووي النووي بشكل أفضل.

Protocol

1. تجميع جزيئات النيوكليوسوم الأساسية عن طريق غسيل الكلى بالملح ملاحظة: تم وصف تحضير جزيئات النواة الأساسية باستخدام بروتينات هيستون المؤتلفة للدراسات الهيكلية على نطاق واسع بالتفصيل من قبل الآخرين14،15،16. اتبع تنق…

Representative Results

تم استخدام NCPs المجمعة بشكل صحيح (الشكل 2) لصنع مركب مع بروتين اندماج مؤتلف من MBP-Polβ-APE1 (الشكل 3). لتحديد نسبة NCP إلى MBP-Polβ-APE1 لتشكيل مجمع مستقر ، أجرينا مقايسات تحول الحركة الكهربية (EMSA) (الشكل 4) ، والتي أظهرت نطاقا متغيرا منفردا من NCP مع زيادة مول?…

Discussion

يعتمد بروتوكول محدد لتنقية عامل إصلاح الحمض النووي على الإنزيم محل الاهتمام. ومع ذلك ، هناك بعض التوصيات العامة ، بما في ذلك استخدام الطرق المؤتلفة للتعبير عن البروتين وتنقيته18 ؛ إذا كان البروتين محل الاهتمام صغيرا جدا (<50 كيلو دالتون) ، فإن تحديد الهيكل بواسطة cryo-EM كان شبه مست…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ماريو بورجنيا من نواة cryo-EM في المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية والدكتور جوشوا شتراوس من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل على إرشادهم وتدريبهم في إعداد شبكة cryo-EM. كما نشكر الدكتورة جوليانا ميلو دا فونسيكا ريزيندي على المساعدة التقنية في المراحل الأولية من هذا المشروع. نحن نقدر المساهمة والدعم الرئيسيين للراحل الدكتور صموئيل ويلسون وأعضاء مختبره ، وخاصة الدكتور راجندرا براساد والدكتور جوناس جامسن لتنقية مركب APE1-Polβ المنصهر وراثيا. تم دعم البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة ، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية [أرقام المنح Z01ES050158 و Z01ES050159 و K99ES031662-01].

Materials

1 M HEPES; pH 7.5 Thermo Fisher Scientific 15630080
1 M MgCl2 Thermo Fisher Scientific AM9530G
10x TBE Bio-rad 1610733
25% glutaraldehyde Fisher Scientific 50-262-23
3 M KCl Thermo Fisher Scientific 043398.K2
491 prep cell Bio-rad 1702926
Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma Z717185
Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) Millipore Sigma UFC8030
AutoGrid Tweezers Ted Pella 47000-600
Automatic Plunge Freezer Leica Leica EM GP
C-1000 touch thermocycler Bio-rad 1851148
C-clips and rings Thermo Fisher 6640–6640
Clipping station SubAngostrom SCT08
Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) Fisher Scientific 15370752
Diamond Tweezers Techni-Pro 758TW0010
dsDNA Integrated DNA techonologies N/A
FEI Titan Krios Thermo Fisher KRIOSG4TEM
FPLC purification system AKTA Pure 29018224
Fraction collector Model 2110 Bio-rad 7318122
Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000S
Grid Boxes SubAngostrom PB-E
Grid Storage Accessory Pack SubAngostrom GSAX
Liquid Ethane N/A N/A
Liquid Nitrogen N/A N/A
Minipuls 3 peristaltic two-head pump Gilson F155008
Nanodrop Thermo Fisher Scientific ND-2000
Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels Thermo Fisher Scientific EC6695BOX
Pipetman Gilson FA10002M
Pipette tips (VWR) Low Retention VWR 76322-528
Polyacrylamide gel solution (37.5:1) Bio-rad 1610158
polyethylene glycol (PEG) Millipore Sigma P4338-500G
Pur-A-lyzer Maxi 3500 Millipore Sigma PURX35050
Purified recombinant DNA repair factor N/A N/A
R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids Quantifoil N1-C14nCu30-01
Recombinant histone octamer N/A N/A
Spring clipping tools SubAngostrom CSA-01
Superdex 200 column 10/300 Millipore Sigma GE28-9909-44
Transmission Electron Microscope Thermo Fisher Talos Arctica 200 kV
Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I Ted Pella 47000-500
UltraPure Glycerol Thermo Fisher Scientific 15514011
Vitrobot Thermo Fisher Mark IV System
Whatman Filter paper (55 mM) Cytiva 1005-055
Xylene cyanol Thermo Fisher Scientific 440700500
Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL Thermo Fisher Scientific 89877

References

  1. Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
  4. Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
  5. Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
  6. McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
  7. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
  8. Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
  9. Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
  10. Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
  11. Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
  12. Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
  13. Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
  15. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
  16. McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
  17. Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
  18. Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
  19. Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
  20. Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
  21. Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
  22. Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
  23. Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).

Play Video

Cite This Article
Rodriguez, Y., Butay, K. J., Sharma, K., Viverette, E., Wilson, S. H. Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination. J. Vis. Exp. (186), e64061, doi:10.3791/64061 (2022).

View Video