Préparation de particules de noyau de nucléosomes complexées avec des facteurs de réparation de l’ADN pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique
Summary
Ce protocole décrit en détail la préparation des complexes nucléosomiques à l’aide de deux méthodes de préparation des échantillons pour la congélation des grilles TEM.
Abstract
La réparation de l’ADN dans le contexte de la chromatine est mal comprise. Des études biochimiques utilisant des particules de noyau de nucléosome, l’unité répétitive fondamentale de la chromatine, montrent que la plupart des enzymes de réparation de l’ADN éliminent les dommages à l’ADN à des taux réduits par rapport à l’ADN libre. Les détails moléculaires sur la façon dont les enzymes de réparation par excision de base (BER) reconnaissent et éliminent les dommages à l’ADN dans les nucléosomes n’ont pas été élucidés. Cependant, les données biochimiques BER des substrats nucléosomales suggèrent que le nucléosome présente différentes barrières structurelles en fonction de l’emplacement de la lésion de l’ADN et de l’enzyme. Cela indique que les mécanismes employés par ces enzymes pour éliminer les dommages à l’ADN dans l’ADN libre peuvent être différents de ceux employés dans les nucléosomes. Étant donné que la majorité de l’ADN génomique est assemblée en nucléosomes, des informations structurelles sur ces complexes sont nécessaires. À ce jour, la communauté scientifique ne dispose pas de protocoles détaillés pour réaliser des études structurelles techniquement réalisables de ces complexes. Ici, nous fournissons deux méthodes pour préparer un complexe de deux enzymes BER génétiquement fusionnées (polymérase β et endonucléase AP1) liées à un espace mononucléotidique près de l’entrée-sortie du nucléosome pour la détermination structurelle de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Les deux méthodes de préparation des échantillons sont compatibles pour vitrifier les grilles de qualité par congélation. Ce protocole peut être utilisé comme point de départ pour préparer d’autres complexes nucléosomiques avec différents facteurs BER, facteurs de transcription pionniers et enzymes modifiant la chromatine.
Introduction
L’ADN eucaryote est organisé et compacté par les protéines histones, formant de la chromatine. La particule centrale du nucléosome (NCP) constitue l’unité répétitive fondamentale de la chromatine qui régule l’accessibilité aux protéines de liaison à l’ADN pour la réparation, la transcription et la réplication de l’ADN1. Bien que la première structure cristalline en rayons X du NCP ait été résolue pour la première fois il y a plus de deux décennies2 et que de nombreuses autres structures du NCP aient été publiées depuis 3,4,5,6, les mécanismes de réparation de l’ADN dans les substrats nucléosomaux n’ont pas encore été délimités. La découverte des détails moléculaires sous-jacents à la réparation de l’ADN dans la chromatine nécessitera une caractérisation structurale des composants participants afin de comprendre comment les caractéristiques structurelles locales du PCN régulent les activités de réparation de l’ADN. Ceci est particulièrement important dans le contexte de la réparation par excision de base (BER) étant donné que les études biochimiques avec des enzymes BER suggèrent des mécanismes uniques de réparation de l’ADN dans les nucléosomes qui dépendent des exigences structurelles spécifiques à l’enzyme pour la catalyse et de la position structurelle de la lésion de l’ADN dans le nucléosome 7,8,9,10,11,12,13 . Étant donné que le BER est un processus vital de réparation de l’ADN, il existe un intérêt considérable à combler ces lacunes tout en établissant un point de départ à partir duquel d’autres études structurelles techniquement réalisables impliquant des complexes nucléosomaux pertinents peuvent être réalisées.
Cryo-EM devient rapidement la méthode de choix pour résoudre la structure tridimensionnelle (3D) de complexes dont la préparation à grande échelle d’échantillons homogènes est difficile. Bien que la conception et la purification de NCP complexés avec un facteur de réparation de l’ADN (NCP-DRF) nécessiteront probablement une optimisation sur mesure, la procédure présentée ici pour générer et congeler un complexe NCP-DRF stable fournit des détails sur la façon d’optimiser la préparation de l’échantillon et de la grille cryo-EM. Deux workflows (non mutuellement exclusifs) illustrés à la figure 1 et les détails spécifiques du protocole identifient les étapes critiques et fournissent des stratégies pour optimiser ces étapes. Ce travail propulsera le domaine de la chromatine et de la réparation de l’ADN dans une direction où il devient techniquement possible de compléter les études biochimiques par des études structurales pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réparation de l’ADN nucléosomique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocole spécifique pour purifier le facteur de réparation de l’ADN dépendra de l’enzyme d’intérêt. Cependant, il existe certaines recommandations générales, notamment l’utilisation de méthodes recombinantes pour l’expression et la purification des protéines18; si la protéine d’intérêt est trop petite (<50 kDa), la détermination de la structure par cryo-EM était presque impossible jusqu’à plus récemment grâce à l’utilisation de systèmes de fusion<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Mario Borgnia du noyau cryo-EM de l’Institut national des sciences de la santé environnementale et le Dr Joshua Strauss de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill pour leur mentorat et leur formation à la préparation de la grille cryo-EM. Nous remercions également le Dr Juliana Mello Da Fonseca Rezende pour son assistance technique dans les premières étapes de ce projet. Nous apprécions la contribution et le soutien clés du regretté Dr Samuel H. Wilson et des membres de son laboratoire, en particulier le Dr Rajendra Prasad et le Dr Joonas Jamsen pour la purification du complexe APE1-Polβ génétiquement fusionné. La recherche a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [numéros de subvention Z01ES050158, Z01ES050159 et K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
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