Beredning av nukleosomkärnpartiklar komplexerade med DNA-reparationsfaktorer för kryoelektronmikroskopi Strukturell bestämning
Summary
Detta protokoll beskriver i detalj beredningen av nukleosomala komplex med användning av två metoder för provberedning för frysning av TEM-galler.
Abstract
DNA-reparation i samband med kromatin är dåligt förstådd. Biokemiska studier med nukleosomkärnpartiklar, den grundläggande upprepande enheten av kromatin, visar att de flesta DNA-reparationsenzymer tar bort DNA-skador med reducerade hastigheter jämfört med fritt DNA. De molekylära detaljerna om hur basexcisionsreparationsenzymer (BER) känner igen och tar bort DNA-skador i nukleosomer har inte klarlagts. Biokemiska BER-data för nukleosomala substrat tyder emellertid på att nukleosomen uppvisar olika strukturella barriärer beroende på platsen för DNA-lesionen och enzymet. Detta indikerar att mekanismerna som används av dessa enzymer för att avlägsna DNA-skador i fritt DNA kan vara annorlunda än de som används i nukleosomer. Med tanke på att majoriteten av genomiskt DNA monteras i nukleosomer behövs strukturell information om dessa komplex. Hittills saknar det vetenskapliga samfundet detaljerade protokoll för att utföra tekniskt genomförbara strukturella studier av dessa komplex. Här tillhandahåller vi två metoder för att förbereda ett komplex av två genetiskt smälta BER-enzymer (polymeras β och AP Endonuclease1) bundna till ett enda nukleotidgap nära nukleosomens inträde-utgång för kryoelektronmikroskopi (kryo-EM) strukturbestämning. Båda metoderna för provberedning är kompatibla för förglasning av kvalitetsgaller via doppfrysning. Detta protokoll kan användas som utgångspunkt för att förbereda andra nukleosomala komplex med olika BER-faktorer, pionjärtranskriptionsfaktorer och kromatinmodifierande enzymer.
Introduction
Eukaryot DNA organiseras och komprimeras av histonproteiner och bildar kromatin. Nukleosomkärnpartikeln (NCP) utgör den grundläggande upprepande enheten av kromatin som reglerar tillgängligheten till DNA-bindande proteiner för DNA-reparation, transkription och replikation1. Även om den första röntgenkristallstrukturen i NCP först löstes för mer än två decennier sedan2 och många fler strukturer av NCP har publicerats sedan 3,4,5,6, har DNA-reparationsmekanismer i nukleosomala substrat ännu inte avgränsats. Att avslöja de molekylära detaljerna som ligger till grund för DNA-reparation i kromatin kommer att kräva strukturell karakterisering av de deltagande komponenterna för att förstå hur lokala strukturella egenskaper hos NCP reglerar DNA-reparationsaktiviteter. Detta är särskilt viktigt i samband med reparation av basexcision (BER) med tanke på att biokemiska studier med BER-enzymer tyder på unika DNA-reparationsmekanismer i nukleosomer som är beroende av enzymspecifika strukturella krav för katalys och DNA-lesionens strukturella position inom nukleosomen 7,8,9,10,11,12,13 . Med tanke på att BER är en viktig DNA-reparationsprocess finns det ett stort intresse för att fylla i dessa luckor och samtidigt fastställa en utgångspunkt från vilken andra tekniskt genomförbara strukturstudier med relevanta nukleosomkomplex kan utföras.
Cryo-EM blir snabbt den valda metoden för att lösa den tredimensionella (3D) strukturen hos komplex vars storskaliga beredning av homogent prov är utmanande. Även om design och rening av NCP: er komplexerade med en DNA-reparationsfaktor (NCP-DRF) sannolikt kommer att kräva skräddarsydd optimering, ger proceduren som presenteras här för att generera och frysa ett stabilt NCP-DRF-komplex detaljer om hur man optimerar provet och kryo-EM-nätberedningen. Två arbetsflöden (inte ömsesidigt uteslutande) som visas i figur 1 och den specifika informationen i protokollet identifierar kritiska steg och tillhandahåller strategier för att optimera dessa steg. Detta arbete kommer att driva kromatin- och DNA-reparationsfältet i en riktning där komplementering av biokemiska med strukturella studier blir tekniskt genomförbart för att bättre förstå de molekylära mekanismerna för nukleosomal DNA-reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ett specifikt protokoll för rening av DNA-reparationsfaktorn kommer att vara beroende av enzymet av intresse. Det finns emellertid några allmänna rekommendationer, inklusive användning av rekombinanta metoder för proteinuttryck och rening18; om proteinet av intresse är för litet (<50 kDa) hade strukturbestämning med kryo-EM varit nästan omöjligt tills nyligen genom användning av fusionssystem19, nanokroppsbindande byggnadsställningar20 oc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. Mario Borgnia från cryo-EM-kärnan vid National Institute of Environmental Health Sciences och Dr. Joshua Strauss från University of North Carolina at Chapel Hill för deras mentorskap och utbildning i kryo-EM-nätberedningen. Vi tackar också Dr. Juliana Mello Da Fonseca Rezende för teknisk hjälp i de inledande stadierna av detta projekt. Vi uppskattar det viktiga bidraget och stödet från den avlidne Dr. Samuel H. Wilson och hans laboratoriemedlemmar, särskilt Dr. Rajendra Prasad och Dr. Joonas Jamsen för rening av det genetiskt smälta APE1-Polβ-komplexet. Forskning har fått stöd av det intramurala forskningsprogrammet vid National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences [bidragsnummer Z01ES050158, Z01ES050159 och K99ES031662-01].
Materials
| 1 M HEPES; pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | AM9530G | |
| 10x TBE | Bio-rad | 1610733 | |
| 25% glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| 3 M KCl | Thermo Fisher Scientific | 043398.K2 | |
| 491 prep cell | Bio-rad | 1702926 | |
| Amicon Ultra 15 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | Z717185 | |
| Amicon Ultra 4 centrifugal filter (MW cutoff 30 kDa) | Millipore Sigma | UFC8030 | |
| AutoGrid Tweezers | Ted Pella | 47000-600 | |
| Automatic Plunge Freezer | Leica | Leica EM GP | |
| C-1000 touch thermocycler | Bio-rad | 1851148 | |
| C-clips and rings | Thermo Fisher | 6640–6640 | |
| Clipping station | SubAngostrom | SCT08 | |
| Dialysis Membrane (MW cufoff 6-8 kDa) | Fisher Scientific | 15370752 | |
| Diamond Tweezers | Techni-Pro | 758TW0010 | |
| dsDNA | Integrated DNA techonologies | N/A | |
| FEI Titan Krios | Thermo Fisher | KRIOSG4TEM | |
| FPLC purification system | AKTA Pure | 29018224 | |
| Fraction collector Model 2110 | Bio-rad | 7318122 | |
| Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S | |
| Grid Boxes | SubAngostrom | PB-E | |
| Grid Storage Accessory Pack | SubAngostrom | GSAX | |
| Liquid Ethane | N/A | N/A | |
| Liquid Nitrogen | N/A | N/A | |
| Minipuls 3 peristaltic two-head pump | Gilson | F155008 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| Novex 16%, Tricine, 1.0 mm, Mini Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | EC6695BOX | |
| Pipetman | Gilson | FA10002M | |
| Pipette tips (VWR) Low Retention | VWR | 76322-528 | |
| Polyacrylamide gel solution (37.5:1) | Bio-rad | 1610158 | |
| polyethylene glycol (PEG) | Millipore Sigma | P4338-500G | |
| Pur-A-lyzer Maxi 3500 | Millipore Sigma | PURX35050 | |
| Purified recombinant DNA repair factor | N/A | N/A | |
| R 1.2/1.3 Cu 300 mesh Grids | Quantifoil | N1-C14nCu30-01 | |
| Recombinant histone octamer | N/A | N/A | |
| Spring clipping tools | SubAngostrom | CSA-01 | |
| Superdex 200 column 10/300 | Millipore Sigma | GE28-9909-44 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Fisher | Talos Arctica 200 kV | |
| Tweezers Assembly for FEI Vitrobot Mark IV-I | Ted Pella | 47000-500 | |
| UltraPure Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 15514011 | |
| Vitrobot | Thermo Fisher | Mark IV System | |
| Whatman Filter paper (55 mM) | Cytiva | 1005-055 | |
| Xylene cyanol | Thermo Fisher Scientific | 440700500 | |
| Zeba Micro Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 75 µL | Thermo Fisher Scientific | 89877 |
References
- Ehrenhofer-Murray, A. E. Chromatin dynamics at DNA replication, transcription and repair. European Journal of Biochemistry. 271 (12), 2335-2349 (2004).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Davey, C. A., Sargent, D. F., Luger, K., Maeder, A. W., Richmond, T. J. Solvent mediated interactions in the structure of the nucleosome core particle at 1.9 a resolution. Journal of Molecular Biology. 319 (5), 1097-1113 (2002).
- Suto, R. K., Clarkson, M. J., Tremethick, D. J., Luger, K. Crystal structure of a nucleosome core particle containing the variant histone H2A.Z. Nature Structural Biology. 7 (12), 1121-1124 (2000).
- Tachiwana, H., et al. Crystal structure of the human centromeric nucleosome containing CENP-A. Nature. 476 (7359), 232-235 (2011).
- McGinty, R. K., Tan, S. Nucleosome structure and function. Chemical Reviews. 115 (6), 2255-2273 (2015).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Laughery, M. F., Wyrick, J. J., Smerdon, M. J. Site-specific acetylation of histone H3 decreases polymerase beta activity on nucleosome core particles in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 291 (21), 11434-11445 (2016).
- Rodriguez, Y., Hinz, J. M., Smerdon, M. J. Accessing DNA damage in chromatin: Preparing the chromatin landscape for base excision repair. DNA Repair (Amst). 32, 113-119 (2015).
- Rodriguez, Y., Horton, J. K., Wilson, S. H. Histone H3 lysine 56 acetylation enhances AP endonuclease 1-mediated repair of AP sites in nucleosome core particles. Biochemistry. 58 (35), 3646-3655 (2019).
- Rodriguez, Y., Howard, M. J., Cuneo, M. J., Prasad, R., Wilson, S. H. Unencumbered Pol beta lyase activity in nucleosome core particles. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8901-8915 (2017).
- Rodriguez, Y., Smerdon, M. J. The structural location of DNA lesions in nucleosome core particles determines accessibility by base excision repair enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13863-13875 (2013).
- Olmon, E. D., Delaney, S. Differential ability of five DNA glycosylases to recognize and repair damage on nucleosomal DNA. ACS Chemical Biology. 12 (3), 692-701 (2017).
- Odell, I. D., Wallace, S. S., Pederson, D. S. Rules of engagement for base excision repair in chromatin. Journal of Cellular Physiology. 228 (2), 258-266 (2013).
- Dyer, P. N., et al. Reconstitution of nucleosome core particles from recombinant histones and DNA. Methods in Enzymology. 375, 23-44 (2004).
- Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in Enzymology. 304, 3-19 (1999).
- McGinty, R. K., Makde, R. D., Tan, S. Preparation, crystallization, and structure determination of chromatin enzyme/nucleosome complexes. Methods in Enzymology. 573, 43-65 (2016).
- Lopez-Gomollon, S., Nicolas, F. E. Purification of DNA oligos by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Methods in Enzymology. 529, 65-83 (2013).
- Burgess, R. R. D., Murray, P. . Guide to Protein Purification. 463, (2009).
- Coscia, F., et al. Fusion to a homo-oligomeric scaffold allows cryo-EM analysis of a small protein. Scientific Reports. 6, 30909 (2016).
- Wu, X., Rapoport, T. A. Cryo-EM structure determination of small proteins by nanobody-binding scaffolds (Legobodies). Proceedings of the Nationall Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), 2115001118 (2021).
- Herzik, M. A., Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nature Communications. 10 (1), 1032 (2019).
- Takizawa, Y., et al. Cryo-EM structure of the nucleosome containing the ALB1 enhancer DNA sequence. Open Biology. 8 (3), 170255 (2018).
- Anderson, C. J., et al. Structural basis for recognition of ubiquitylated nucleosome by Dot1L methyltransferase. Cell Reports. 26 (7), 1681-1690 (2019).
