बड़े पैमाने पर ग्रेविटैक्सिस कैनोरहाब्डाइटिस के दाउर लार्वा परख
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल कैनोरहाब्डाइटिस डाउर लार्वा के साथ बड़े पैमाने पर गुरुत्वाकर्षण परख आयोजित करने के तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है। यह प्रोटोकॉल प्लेट-आधारित परख की तुलना में गुरुत्वाकर्षण व्यवहार का बेहतर पता लगाने की अनुमति देता है।
Abstract
गुरुत्वाकर्षण संवेदना एक महत्वपूर्ण और अपेक्षाकृत कम अध्ययन की जाने वाली प्रक्रिया है। संवेदन गुरुत्वाकर्षण जानवरों को अपने परिवेश को नेविगेट करने में सक्षम बनाता है और आंदोलन की सुविधा प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, गुरुत्वाकर्षण सनसनी, जो स्तनधारी आंतरिक कान में होती है, सुनवाई से निकटता से संबंधित है – इस प्रकार, इस प्रक्रिया को समझने से श्रवण और वेस्टिबुलर अनुसंधान के लिए निहितार्थ हैं। ड्रोसोफिला सहित कुछ मॉडल जीवों के लिए गुरुत्वाकर्षण परख मौजूद हैं। एकल कीड़े पहले उनके अभिविन्यास वरीयता के लिए परख किया गया है के रूप में वे समाधान में बस. हालांकि, कैनोरहाब्डाइटिस गुरुत्वाकर्षण के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत परख का वर्णन नहीं किया गया है। वर्तमान प्रोटोकॉल गुरुत्वाकर्षण परख करने के लिए एक प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करता है जिसका उपयोग एक समय में सैकड़ों कैनोरहाब्डाइटिस डॉयर्स का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यह बड़े पैमाने पर, लंबी दूरी की परख विस्तृत डेटा संग्रह के लिए अनुमति देती है, फेनोटाइप का खुलासा करती है जिसे मानक प्लेट-आधारित परख पर याद किया जा सकता है। ऊर्ध्वाधर अक्ष के साथ डाउर आंदोलन की तुलना क्षैतिज नियंत्रणों के साथ की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि दिशात्मक पूर्वाग्रह गुरुत्वाकर्षण के कारण है। गुरुत्वाकर्षण वरीयता की तुलना उपभेदों या प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच की जा सकती है। यह विधि कीड़े में गुरुत्वाकर्षण के लिए आणविक, सेलुलर और पर्यावरणीय आवश्यकताओं को निर्धारित कर सकती है।
Introduction
पृथ्वी के गुरुत्वाकर्षण खिंचाव को महसूस करना कई जीवों के अभिविन्यास, आंदोलन, समन्वय और संतुलन के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि, गुरुत्वाकर्षण संवेदना के आणविक तंत्र और न्यूरोसर्किटरी को अन्य इंद्रियों की तुलना में खराब समझा जाता है। जानवरों में, गुरुत्वाकर्षण संवेदना व्यवहार को प्रभावित करने के लिए अन्य उत्तेजनाओं के साथ बातचीत करती है और इसे पछाड़ दिया जा सकता है। दृश्य संकेत, प्रोप्रियोसेप्टिव फीडबैक और वेस्टिबुलर जानकारी को एक जानवर के परिवेश 1,2 के सापेक्ष शरीर की जागरूकता की भावना उत्पन्न करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है। इसके विपरीत, गुरुत्वाकर्षण वरीयता को अन्य उत्तेजनाओं 3,4,5 की उपस्थिति में बदला जा सकता है। इसलिए, गुरुत्वाकर्षण व्यवहार गुरुत्वाकर्षण संवेदना का अध्ययन करने और तंत्रिका तंत्र के जटिल संवेदी एकीकरण और निर्णय लेने को समझने के लिए आदर्श है।
एलिगेंस अपने पॉलीफेनिक जीवनचक्र के कारण गुरुत्वाकर्षण का अध्ययन करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी मॉडल जीव है। जब गर्मी, भीड़भाड़, या भोजन की कमी सहित विकास के दौरान तनाव के संपर्क में आते हैं, तो सी एलिगेंस लार्वा डौअर्स में विकसित होते हैं, जो अत्यधिक तनाव प्रतिरोधी होते हैं6. डावर्स के रूप में, कीड़े विशिष्ट व्यवहार करते हैं, जैसे कि निक्टेशन, जिसमें कीड़े अपनी पूंछ पर “खड़े” होते हैं और अपने सिर को लहराते हैं, जो बेहतर आवास7 के लिए फैलाव की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। जेपोनिका के गुरुत्वाक्ष परख से पता चलता है कि डाउर लार्वा नकारात्मक रूप से गुरुत्वाकर्षण, और यह व्यवहार वयस्कों 8,9 की तुलना में डाउर्स में अधिक आसानी से मनाया जाता है। अन्य कैनोरहाब्डाइटिस उपभेदों में गुरुत्वाकर्षण का परीक्षण गुरुत्वाकर्षण व्यवहार में प्राकृतिक भिन्नता को प्रकट कर सकता है।
गुरुत्वाकर्षण संवेदना के लिए तंत्र को यूगलेना, ड्रोसोफिला, सिओना और विभिन्न अन्य प्रजातियों में गुरुत्वाकर्षण परख 3,10,11 का उपयोग करके विशेषता दी गई है। इस बीच, कैनोरहाब्डाइटिस में गुरुत्वाकर्षण अध्ययन ने शुरू में मिश्रित परिणाम प्रदान किए। एलिगेंस ओरिएंटेशनल वरीयता के एक अध्ययन में पाया गया कि कीड़े समाधान में अपने सिर के साथ उन्मुख होते हैं, सकारात्मक गुरुत्वाकर्षण वरीयता12 का सुझाव देते हैं। इस बीच, हालांकि सी जैपोनिका डाउर्स को नकारात्मक रूप से गुरुत्वाकर्षण8 होने के रूप में जल्दी पहचाना गया था, इस व्यवहार को हाल ही में सी एलिगेंस9 में वर्णित किया गया है। कीड़े में एक प्रतिनिधि गुरुत्वाकर्षण परख विकसित करने में कई चुनौतियां उत्पन्न होती हैं। अगर प्लेटों पर कैनोरहाब्डाइटिस उपभेदों को बनाए रखा जाता है; इस कारण से, व्यवहार परख आमतौर पर अपने प्रयोगात्मक डिजाइन13,14,15 के हिस्से के रूप में अगर प्लेटों का उपयोग करते हैं। कैनोरहाब्डाइटिस में जल्द से जल्द रिपोर्ट की गई गुरुत्वाकर्षण परख क्षैतिज नियंत्रण प्लेट8 के लिए 90 ° कोण पर अपनी तरफ एक प्लेट खड़ी करके की गई थी। हालांकि, गुरुत्वाकर्षण व्यवहार इन स्थितियों में हमेशा मजबूत नहीं होता है। जबकि वयस्क कीड़े को समाधान12 में अभिविन्यास वरीयता के लिए परख किया जा सकता है, यह दिशात्मक वरीयता संदर्भ-निर्भर भी हो सकती है, जिससे विभिन्न व्यवहार हो सकते हैं यदि कीड़े तैराकी के बजाय रेंग रहे हैं। एलिगेंस प्रकाश और विद्युत चुम्बकीय क्षेत्र16,17 सहित अन्य उत्तेजनाओं के प्रति संवेदनशील है, जो गुरुत्वाकर्षण9 के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं में हस्तक्षेप करते हैं। इसलिए, एक अद्यतन गुरुत्वाकर्षण परख जो अन्य पर्यावरणीय चर के खिलाफ ढालती है, इस संवेदी प्रक्रिया के तंत्र को विच्छेदन करने के लिए महत्वपूर्ण है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में, कैनोरहाब्डाइटिस गुरुत्वाकर्षण का अवलोकन करने के लिए एक परख का वर्णन किया गया है। इस अध्ययन के लिए सेटअप न्यूरोमस्कुलर अखंडता18,19 का अध्ययन करने के लिए विकसित एक विधि पर आधारित है। डाउर लार्वा को मानक प्रक्रियाओं का उपयोग करके सुसंस्कृत और पृथक किया जाता है20. फिर उन्हें अगर से भरे दो 5 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट से बने कक्षों में इंजेक्ट किया जाता है। इन कक्षों को लंबवत या क्षैतिज रूप से उन्मुख किया जा सकता है और प्रकाश और विद्युत चुम्बकीय क्षेत्रों के खिलाफ ढाल के लिए 12-24 घंटे के लिए एक अंधेरे फैराडे पिंजरे के भीतर रखा जा सकता है। कक्षों में प्रत्येक कीड़े का स्थान दर्ज किया जाता है और संदर्भ तनाव के ऊर्ध्वाधर टैक्सियों के साथ तुलना की जाती है जैसे कि सी।
Protocol
Representative Results
Discussion
पूर्व विधियों के साथ तुलना
केमोटैक्सिस के विपरीत, कैनोरहाब्डाइटिस में गुरुत्वाकर्षण को पारंपरिक अगर प्लेट प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग करके मज़बूती से नहीं देखा जा सकता है। एक मानक पेट्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से जेएचआर (#R01 5R01HD081266 और #R01GM141493) के अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। सीजीसी द्वारा कुछ उपभेद प्रदान किए गए थे, जो एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (पी 40 ओडी 010440) द्वारा वित्त पोषित है। हम प्रदीप जोशी (यूसीएसबी) को उनके संपादकीय इनपुट के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। यूसीएसबी डाटालैब द्वारा प्रदान किया गया सांख्यिकीय परामर्श।
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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