Summary

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Published: May 31, 2022
doi:

Summary

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Abstract

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell’ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell’orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all’udito – quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l’esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l’asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Introduction

Percepire l’attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l’orientamento, il movimento, la coordinazione e l’equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all’ambiente circostante di un animale 1,2. Al contrario, la preferenza gravitattica può essere alterata in presenza di altri stimoli 3,4,5. Pertanto, il comportamento gravitattico è ideale per studiare la sensazione di gravità e comprendere la complessa integrazione sensoriale e il processo decisionale del sistema nervoso.

C. elegans è un organismo modello particolarmente utile per lo studio della gravitassi a causa del suo ciclo di vita polifenico. Se esposte a fattori di stress durante lo sviluppo, tra cui calore, sovraffollamento o mancanza di cibo, le larve di C. elegans si sviluppano in dauers, che sono altamente resistenti allo stress6. Come dauers, i vermi svolgono comportamenti caratteristici, come la nictazione, in cui i vermi “stanno in piedi” sulla coda e agitano la testa, che possono facilitare la dispersione verso habitat migliori7. I saggi di gravitaxis di C. elegans e C. japonica suggeriscono che le larve di dauer gravitassano negativamente e che questo comportamento è più facilmente osservato nei pazienti che negli adulti 8,9. Il test della gravitassi in altri ceppi di Caenorhabditis può rivelare variazioni naturali nel comportamento gravitattico.

I meccanismi per la sensazione di gravità sono stati caratterizzati in Euglena, Drosophila, Ciona e varie altre specie usando i saggi di gravitaxis 3,10,11. Nel frattempo, gli studi sulla gravitaxis a Caenorhabditis inizialmente hanno fornito risultati contrastanti. Uno studio sulla preferenza orientativa di C. elegans ha scoperto che i vermi si orientano a testa bassa in soluzione, suggerendo una preferenza gravitattica positiva12. Nel frattempo, sebbene i dauers di C. japonica siano stati identificati precocemente come gravitattici negativi8, questo comportamento è stato descritto solo recentemente in C. elegans9. Diverse sfide sorgono nello sviluppo di un saggio di gravitaxis rappresentativo nei vermi. I ceppi di Caenorhabditis sono mantenuti su piastre di agar; Per questo motivo, i saggi comportamentali utilizzano tipicamente piastre di agar come parte del loro disegno sperimentale13,14,15. Il primo test di gravitassi riportato in Caenorhabditis è stato eseguito posizionando una piastra su un lato con un angolo di 90 ° rispetto alla piastra di controllo orizzontale8. Tuttavia, il comportamento della gravitassi non è sempre robusto in queste condizioni. Mentre i vermi adulti possono essere saggiati per la preferenza orientativa nella soluzione12, questa preferenza direzionale può anche essere dipendente dal contesto, portando a comportamenti diversi se i vermi strisciano piuttosto che nuotare. Inoltre, C. elegans è sensibile ad altri stimoli, tra cui la luce e i campi elettromagnetici16,17, che interferiscono con le loro risposte alla gravità9. Pertanto, un test di gravitassi aggiornato che scherma contro altre variabili ambientali è importante per sezionare i meccanismi di questo processo sensoriale.

Nel presente protocollo viene descritto un saggio per l’osservazione della Caenorhabditis gravitaxis. La configurazione di questo studio si basa in parte su un metodo sviluppato per studiare l’integrità neuromuscolare18,19. Le larve di Dauer sono coltivate e isolate con procedure standard20. Vengono quindi iniettati in camere costituite da due pipette sierologiche da 5 ml riempite con agar. Queste camere possono essere orientate verticalmente o orizzontalmente e posizionate all’interno di una gabbia di Faraday buia per 12-24 ore per schermare dalla luce e dai campi elettromagnetici. La posizione di ciascun verme nelle camere viene registrata e confrontata con i taxi verticali di un ceppo di riferimento come C. elegans N2.

Protocol

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers. 1. Preparazione della camera Lavora in una cappa aspirante. Impostare l’area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali). Per ogni …

Representative Results

Confronto tra gravitassi tra specieSeguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva a…

Discussion

Confronto con i metodi precedenti
A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione<sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca del National Institutes of Health al JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall’Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Vorremmo ringraziare Pradeep Joshi (UCSB) per il suo contributo editoriale. Consulenza statistica fornita dall’UCSB DATALAB.

Materials

1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media – 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

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Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

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