Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer
Summary
В настоящем протоколе изложены методы проведения крупномасштабного гравитаксисового анализа с личинками Caenorhabditis dauer. Этот протокол позволяет лучше обнаруживать поведение гравитаксиса по сравнению с анализом на основе пластин.
Abstract
Ощущение гравитации является важным и относительно недостаточно изученным процессом. Ощущение гравитации позволяет животным ориентироваться в окружающей среде и облегчает движение. Кроме того, гравитационное ощущение, которое возникает во внутреннем ухе млекопитающих, тесно связано со слухом – таким образом, понимание этого процесса имеет значение для слуховых и вестибулярных исследований. Гравитаксисовые анализы существуют для некоторых модельных организмов, включая дрозофилу. Одиночные черви ранее были проанализированы на предмет их предпочтения ориентации, когда они оседают в растворе. Тем не менее, надежный и надежный анализ для Caenorhabditis gravitaxis не был описан. Настоящий протокол описывает процедуру выполнения гравитаксис-анализов, которые могут быть использованы для тестирования сотен caenorhabditis dauers одновременно. Этот крупномасштабный, дальний анализ позволяет собирать подробные данные, выявляя фенотипы, которые могут быть пропущены в стандартном анализе на основе пластин. Движение Dauer вдоль вертикальной оси сравнивается с горизонтальными элементами управления, чтобы гарантировать, что направленное смещение обусловлено гравитацией. Затем гравитактическое предпочтение можно сравнить между штаммами или экспериментальными условиями. Этот метод может определить молекулярные, клеточные и экологические требования к гравитакси у червей.
Introduction
Ощущение гравитационного притяжения Земли имеет решающее значение для ориентации, движения, координации и равновесия многих организмов. Однако молекулярные механизмы и нейросхема гравитационного ощущения плохо изучены по сравнению с другими органами чувств. У животных гравитационное ощущение взаимодействует и может быть вытеснено другими стимулами для влияния на поведение. Визуальные сигналы, проприоцептивная обратная связь и вестибулярная информация могут быть интегрированы для создания чувства осознания тела относительно окружения животного 1,2. И наоборот, гравитактическое предпочтение может быть изменено при наличии других раздражителей 3,4,5. Таким образом, гравитактическое поведение идеально подходит для изучения гравитационного ощущения и понимания сложной сенсорной интеграции нервной системы и принятия решений.
C. elegans является особенно полезным модельным организмом для изучения гравитаксиса из-за его полифенического жизненного цикла. При воздействии стрессоров во время развития, включая тепло, перенаселенность или недостаток пищи, личинки C. elegans развиваются в дауэров, которые очень устойчивы к стрессу6. Как дауэры, черви выполняют характерное поведение, такое как придирка, при которой черви «стоят» на хвостах и машут головой, что может способствовать расселению в лучшие места обитания7. Анализы Гравитаксиса C. elegans и C. japonica позволяют предположить, что личинки дауэра отрицательно гравитакс, и что такое поведение легче наблюдается у дауэров, чем у взрослых 8,9. Тестирование гравитаксиса в других штаммах Caenorhabditis может выявить естественные изменения в гравитактическом поведении.
Механизмы гравитационного ощущения были охарактеризованы у Euglena, Drosophila, Ciona и различных других видов с использованием анализов гравитаксиса 3,10,11. Между тем, исследования гравитаксиса при caenorhabditis первоначально дали смешанные результаты. Исследование ориентационного предпочтения C. elegans показало, что черви ориентируются с опущенной головой в растворе, предполагая положительное гравитактическое предпочтение12. Между тем, хотя C. japonica dauers были идентифицированы на ранней стадии как отрицательно гравитактические8, это поведение только недавно было описано в C. elegans9. Несколько проблем возникает при разработке репрезентативного анализа гравитаксиса у червей. Штаммы Caenorhabditis сохраняются на агаровых пластинах; по этой причине поведенческие анализы обычно используют агаровые пластины как часть их экспериментального дизайна 13,14,15. Самый ранний зарегистрированный анализ гравитаксиса в Caenorhabditis был выполнен путем стояния пластины на боку под углом 90° к горизонтальной управляющей пластине8. Однако поведение гравитаксиса не всегда устойчиво в этих условиях. В то время как взрослые черви могут быть проанализированы на предмет ориентационного предпочтения в решении12, это направленное предпочтение также может зависеть от контекста, что приводит к различному поведению, если черви ползают, а не плавают. Кроме того, C. elegans чувствителен к другим раздражителям, включая свет и электромагнитные поля16,17, которые мешают их реакциям на гравитацию9. Поэтому обновленный анализ гравитаксиса, который защищает от других переменных окружающей среды, важен для анализа механизмов этого сенсорного процесса.
В настоящем протоколе описан анализ для наблюдения Caenorhabditis gravitaxis. Установка для этого исследования частично основана на методе, разработанном для изучения нервно-мышечной целостности18,19. Личинки Dauer культивируют и изолируют с помощью стандартных процедур20. Затем они вводятся в камеры, изготовленные из двух серологических пипеток по 5 мл, наполненных агаром. Эти камеры могут быть ориентированы вертикально или горизонтально и помещены в темную клетку Фарадея на 12-24 часа для защиты от света и электромагнитных полей. Местоположение каждого червя в камерах регистрируется и сравнивается с вертикальными такси эталонного штамма, такого как C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сравнение с предыдущими методами
В отличие от хемотаксиса, гравитаксис при кенорхабдите не может быть надежно обнаружен с использованием традиционной экспериментальной конструкции агаровой пластины. Стандартная чашка Петри имеет диаметр 150 мм, в результате чего тольк…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано исследовательскими грантами от Национальных институтов здравоохранения для JHR (#R01 5R01HD081266 и #R01GM141493). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы хотели бы поблагодарить Прадипа Джоши (UCSB) за его редакционный вклад. Статистические консультации, предоставляемые UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
References
- Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
- Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
- Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
- Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -. P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
- Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
- Frézal, L., Félix, M. -. A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
- Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
- Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
- Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
- Häder, D. -. P., Hemmersbach, R., Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. , 237-266 (2017).
- Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston’s organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
- Chen, W. -. L., Ko, H., Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
- Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
- Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
- Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
- Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
- Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
- Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
- Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
- Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
- Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn’s test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
- Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
- Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
- Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
- Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
- Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
- Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 2434-2444 (1995).
- Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
- Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
- Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
- Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
- Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
- Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
- Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).
