Ensaio gravitaxis em larga escala de Larvas de Caenorhabditis Dauer
Summary
O presente protocolo descreve métodos para a realização de um ensaio gravitaxis em larga escala com larvas dauer Caenorhabditis . Este protocolo permite uma melhor detecção do comportamento gravitaxis em comparação com um ensaio baseado em placas.
Abstract
A sensação da gravidade é um processo importante e relativamente subestudado. A percepção da gravidade permite que os animais naveguem em seus arredores e facilite o movimento. Além disso, a sensação gravitacional, que ocorre no ouvido interno dos mamíferos, está intimamente relacionada à audição – assim, entender esse processo tem implicações para pesquisas auditivas e vestibulares. Ensaios gravitaxis existem para alguns organismos modelo, incluindo drosophila. Worms únicos já foram avaliados por sua preferência de orientação à medida que se instalam em solução. No entanto, um ensaio confiável e robusto para caenorhabditis gravitaxis não foi descrito. O presente protocolo descreve um procedimento para a realização de ensaios gravitaxis que podem ser usados para testar centenas de dauers caenorhabditis de cada vez. Este ensaio de longa distância e em larga escala permite a coleta detalhada de dados, revelando fenótipos que podem ser perdidos em um ensaio padrão baseado em placas. O movimento de Dauer ao longo do eixo vertical é comparado com controles horizontais para garantir que o viés direcional seja devido à gravidade. A preferência gravitactic pode então ser comparada entre cepas ou condições experimentais. Este método pode determinar requisitos moleculares, celulares e ambientais para gravitaxis em vermes.
Introduction
Sentir a atração gravitacional da Terra é crucial para a orientação, movimento, coordenação e equilíbrio de muitos organismos. No entanto, os mecanismos moleculares e o neurocircuito da sensação gravitacional são mal compreendidos em comparação com outros sentidos. Em animais, a sensação de gravidade interage e pode ser superada por outros estímulos para influenciar o comportamento. Pistas visuais, feedback proprioceptivo e informações vestibulares podem ser integrados para gerar uma sensação de consciência corporal em relação ao entorno de um animal 1,2. Por outro lado, a preferência gravitactica pode ser alterada na presença de outros estímulos 3,4,5. Portanto, o comportamento gravitactic é ideal para estudar a sensação da gravidade e entender a complexa integração sensorial e a tomada de decisões do sistema nervoso.
C. elegans é um organismo modelo especialmente útil para estudar gravitaxis devido ao seu ciclo de vida polifenóico. Quando expostas a estressores durante o desenvolvimento, incluindo calor, superlotação ou falta de alimentos, as larvas C. elegans se desenvolvem em dauers, que são altamente resistentes ao estresse6. Como dauers, os vermes realizam comportamentos característicos, como a nictação, em que os vermes “ficam” em suas caudas e acenam com a cabeça, o que pode facilitar a dispersão para melhores habitats7. Ensaios gravitaxis de C. elegans e C. japonica sugerem que larvas dauer negativamente gravitax, e que este comportamento é mais facilmente observado em dauers do que em adultos 8,9. Testar gravitaxis em outras cepas de Caenorhabditis pode revelar variação natural no comportamento gravitacático.
Mecanismos para a sensação gravitacional têm sido caracterizados em Euglena, Drosophila, Ciona, e várias outras espécies usando ensaios gravitaxis 3,10,11. Enquanto isso, estudos de gravitaxis em Caenorhabditis inicialmente forneceram resultados mistos. Um estudo da preferência orientacional de C. elegans descobriu que os vermes orientam com a cabeça para baixo em solução, sugerindo preferência gravitactica positiva12. Enquanto isso, embora os dauers C. japonica tenham sido identificados no início como sendo negativamente gravitactic8, este comportamento só foi recentemente descrito em C. elegans9. Vários desafios surgem no desenvolvimento de um ensaio representativo de gravitaxis em vermes. As cepas de caenorhabditis são mantidas em placas de ágar; por essa razão, ensaios comportamentais normalmente usam placas de ágar como parte de seu projeto experimental 13,14,15. O ensaio gravitaxis mais antigo relatado em Caenorhabditis foi realizado de pé uma placa ao seu lado em um ângulo de 90° para a placa de controle horizontal8. No entanto, o comportamento gravitaxis nem sempre é robusto nessas condições. Embora os vermes adultos possam ser avaliados para preferência orientacional na solução12, essa preferência direcional também pode ser dependente do contexto, levando a diferentes comportamentos se os vermes estiverem engatinhando em vez de nadar. Além disso, C. elegans é sensível a outros estímulos, incluindo campos leves e eletromagnéticos16,17, que interferem com suas respostas à gravidade9. Portanto, um ensaio gravitaxis atualizado que protege contra outras variáveis ambientais é importante para dissecar os mecanismos desse processo sensorial.
No presente protocolo, é descrito um ensaio para observar caenorhabditis gravitaxis. A configuração deste estudo baseia-se, em parte, em um método desenvolvido para estudar a integridade neuromuscular18,19. As larvas dauer são cultivadas e isoladas usando procedimentos padrão20. Eles são então injetados em câmaras feitas de duas pipetas sorológicas de 5 mL cheias de ágar. Estas câmaras podem ser orientadas vertical ou horizontalmente e colocadas dentro de uma gaiola escura de Faraday por 12-24 h para proteger contra campos claros e eletromagnéticos. A localização de cada verme nas câmaras é registrada e comparada com os táxis verticais de uma cepa de referência como C. elegans N2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparação com métodos anteriores
Ao contrário da quimiotaxis, a gravitaxis em Caenorhabditis não pode ser observada de forma confiável usando um design experimental tradicional de placa de ágar. Uma placa de Petri padrão tem 150 mm de diâmetro, resultando em apenas 75 mm disponíveis em qualquer direção para dauers demonstrarem preferência gravitaxis. Embora a preferência orientacional de C. elegans possa ser avaliada na solução12, este método…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada por bolsas de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde ao JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Algumas cepas foram fornecidas pelo CGC, que é financiado pelo NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Gostaríamos de reconhecer Pradeep Joshi (UCSB) por sua contribuição editorial. Consulta estatística fornecida pelo UCSB DATALAB.
Materials
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media – 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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