Summary
Musehjertetransplantationsmodeller repræsenterer værdifulde forskningsværktøjer til undersøgelse af transplantationsimmunologi. Den nuværende protokol beskriver mus heterotopisk cervikal hjertetransplantation, der involverer placering af manchetter på modtagerens fælles halspulsåre og donorens lungearteriestamme for at muliggøre laminær blodgennemstrømning.
Abstract
Murine-modeller af hjertetransplantation bruges ofte til at studere iskæmi-reperfusionsskade, medfødte og adaptive immunresponser efter transplantation og virkningen af immunmodulerende terapier på transplantatafstødning. Heterotopisk cervikal hjertetransplantation hos mus blev først beskrevet i 1991 ved hjælp af suturerede anastomoser og efterfølgende modificeret til at omfatte manchetteknikker. Denne ændring muliggjorde forbedrede succesrater, og siden da har der været flere rapporter, der har foreslået yderligere tekniske forbedringer. Oversættelse til mere udbredt anvendelse er dog fortsat begrænset på grund af de tekniske vanskeligheder, der er forbundet med graftanastomoser, som kræver præcision for at opnå tilstrækkelig længde og kaliber af manchetterne for at undgå vaskulær anastomotisk vridning eller overdreven spænding, hvilket kan resultere i skade på transplantatet. Den nuværende protokol beskriver en modificeret teknik til udførelse af heterotopisk cervikal hjertetransplantation hos mus, som involverer manchetplacering på modtagerens fælles halspulsåre og donorens lungearterie i overensstemmelse med blodgennemstrømningens retning.
Introduction
Abbott et al. offentliggjorde1 den første beskrivelse af heterotopisk abdominal hjertetransplantation hos rotter i 1964. Disse kirurgiske teknikker blev raffineret og forenklet af Ono et al. i 19692. Corry et al. beskrev først en metode til heterotopisk abdominal hjertetransplantation hos mus i 1973; I lighed med de tidligere rapporterede rottemodeller involverede dette engraftment i værtens mave med revaskularisering ved ende-til-side anastomoser af donorens lungearterie og stigende aorta til modtagerens ringere vena cava og abdominal aorta, henholdsvis3. Heterotopisk cervikal hjertetransplantation hos rotter blev beskrevet af Heron i 1971 ved hjælp af teflonmanchetter fremstillet af 16 G (1,6 mm ydre diameter) intravenøse katetre4. Chen5 og Matsuura et al.6 rapporterede senere heterotopisk cervikal hjertetransplantation hos mus i 1991, hvis teknikker primært adskiller sig i deres metode til re-anastomose. Chens tilgang involverede suturerede anastomoser af donorens stigende aorta til modtagerens halspulsåre og donorens lungearterie til modtagerens ydre jugularvene 5. På grund af den avancerede tekniske færdighed, der kræves til disse mikrokirurgiske suturerede anastomoser, var en betydelig mængde tid og erfaring nødvendig for at opnå en høj succesrate. Matsuura et al. beskrev en metode, der anvendte en ikke-suturmanchetteknik, svarende til den, der blev brugt af Heron, som involverede ende-til-ende anastomoser ved hjælp af ekstra-luminal placering af manchetter. Han formede teflonmanchetter af 22 G (0,8 mm ydre diameter) og 24 G (0,67 mm ydre diameter) intravenøse katetre og placerede dem over modtagerens ydre halsvene og fælles halspulsåre henholdsvis6. Disse manchetter blev derefter anbragt inde i donorens lungearterie og aorta og sikret ved at binde en suturligatur omkring forbindelsen. Denne tilgang udmøntede sig i en forbedret succesrate. Vigtigst af alt resulterede det i en forkortelse af den tid, der kræves for at fuldføre begge cervikale anastomoser, hvilket reducerer den varme iskæmiske tid for transplantatet til mindre end en tredjedel af den ved hjælp af abdominal sutureringsmetoden. Da manchetterne er placeret omkring karrets ydre overflade, er der desuden ikke noget fremmedlegeme udsat for karets lumen, hvilket i høj grad reducerer muligheden for trombose efter operation7. I mellemtiden giver brugen af manchetteknikken støtte omkring karrene på anastomosestedet uden at kræve suturering, hvilket reducerer risikoen for blødning efter revaskularisering6.
Der er foreslået talrige revisioner af denne teknik. For at imødekomme den korte længde af musens fælles halspulsåre (ca. 5 mm) udviklede Tomita et al.8 en modifikation af denne teknik med en mindre arteriel manchet (0,6 mm ydre diameter), mens man udelod at holde suturer og trække arterien direkte gennem manchetten med fine tang i stedet. Wang et al. forenklede yderligere denne tilgang ved at placere 22 G og 24 G manchetter på donorens højre lungearterie og modtagerens højre fælles halspulsåre, henholdsvis9. Forskellige rapporter har beskrevet ændringer af disse tilgange, herunder brugen af specialiserede manchetter, mikrokirurgiske klemmer, kardilatatorer og kardioplegi10,11,12. Især involverer alle disse metoder retrograd cirkulation af blod gennem hjertet, hvor blod strømmer fra modtagerens fælles halspulsåre til donor aorta, koronararterierne, koronar sinus, derefter tømning i højre atrium og udgang fra lungearterien ind i modtagerens ydre jugular vene.
Sammenlignet med indkapsling i maven giver cervikal hjertetransplantation flere fordele. Som tidligere nævnt giver cervikal eksponering mulighed for hurtigere revaskularisering og kortere varme iskæmiske gange6. Den cervikale metode er også mindre invasiv og er forbundet med kortere postoperative restitutionstider, da den undgår en laparotomi6. Det er vigtigt, at ende-til-ende anastomoser med manchetter kan udføres i stedet for ende-til-side anastomoser, hvilket mindsker risikoen for komplikationer såsom anastomotisk blødning. Den abdominale tilgang udgør også en øget risiko for at udvikle trombotiske komplikationer i abdominal aorta eller ringere vena cava, hvilket fører til rygmarvsiskæmi og bagbenslammelse. Den overfladiske cervikale placering af transplantationen giver nem adgang til vurdering af transplantatlevedygtighed ved palpation, elektrokardiografi og invasiv eller ikke-invasiv billeddannelse. Selvom de cervikale transplantater genoptager spontan hjerteaktivitet efter reperfusion, påvirker de ikke signifikant modtagerens systoliske og diastoliske parametre. Denne model giver værdifuld indsigt til at studere cellulære reaktioner efter transplantation, såsom iskæmi-reperfusionsskade og transplantatafstødning. Desuden tilbyder denne model en ideel tilgang til at muliggøre billeddannelse efter transplantation, såsom intravital to-fotonmikroskopi eller positronemissionstomografi (PET) billeddannelse. Til dette formål har vores laboratorium tidligere rapporteret metoder til at afbilde bevægelige væv og organer i musen, herunder slående murinehjerter og aortabugrafter efter heterotopisk cervikal transplantation for at visualisere leukocythandel under iskæmi-reperfusionsskade og inden for aterosklerotiske plaques, henholdsvis13,14,15 . På grund af sin overfladiske placering og lette eksponering er denne model desuden velegnet til hjertetransplantation16.
Denne rapport beskriver en teknik, der giver mulighed for laminær blodgennemstrømning med den eksterne placering af de vaskulære manchetter på de kar, hvorfra blodgennemstrømningen stammer. Dette giver mulighed for en jævn overgang af blodgennemstrømningen fra et kar til det næste, hvilket undgår eksponering af den distale karkant i det vaskulære lumen. Derudover bruger teknikken en større 20 G manchet i stedet for tidligere anvendte 22 G manchetter til donorens lungearterie for at sikre rigelig tilbagevenden af blodgennemstrømningen til modtageren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrehåndteringsprocedurer blev udført i overensstemmelse med NIH Care and Use of Laboratory Animals retningslinjer og godkendt af Animal Studies Committee ved Washington University School of Medicine. Hjerter fra C57BL/6 (B6) og BALB/c mus (vejer 20-25 g) blev transplanteret til kønsmatchede B6-modtagere (6-8 uger). Musene blev hentet fra kommercielle kilder (se Materialetabel). Syngeneic transplantationer blev udført for at evaluere cellulære reaktioner relateret til iskæmi-reperfusionsskade, og allogene transplantationer blev udført for at undersøge immunmekanismerne involveret i grafttolerance og afvisning. B6 lysozym M-grønt fluorescerende protein (LysM-GFP) reporter mus17, oprindeligt opnået fra Klaus Ley fra La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, og efterfølgende opdrættet i vores anlæg, blev brugt som modtagere til udvalgte eksperimenter for at visualisere neutrofil infiltration i hjertetransplantater. Overlevelseskirurgi blev udført ved hjælp af aseptiske procedurer.
1. Donorprocedure
- Anæstetisere musene ved at injicere ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (8-10 mg/kg) (se Materialetabel) intraperitonealt i donormusen. Bekræft kirurgisk anæstesiplan med tå og hale knivspids.
- Forbered det kirurgiske område ved at barbere håret fra brystet og maven ved hjælp af en elektrisk barbermaskine.
- Administrer 100 enheder heparin (se Materialetabel) intravenøst i penisvenen (mænd) eller ekstern jugular vene (mænd eller kvinder).
- Placer musene i liggende stilling med forbenene over hovedet. Fastgør forben og bagben med kirurgisk tape og desinficer huden med tre skiftevis skrubber af 0,75% jod og 70% ethanol.
- Udfør et snit, median laparosternotomy, fra navlestreng til sternal vinkel (3-4 cm), efterfulgt af en bilateral thoracotomi langs hver kystmargen (2 cm bilateralt). Fold den forreste brystvæg over nakken for fuld eksponering af mediastinum.
- Skær thymus og udsæt den intrathoracic inferior vena cava.
- Transect over bredden af abdominal aorta for exsanguination.
- Til retrograd perfusion injiceres 1,5 ml 4 °C saltvand i den intrathoraciske inferior vena cava med nålen orienteret overlegent mod transplantatet, som tidligere beskrevet13.
- Ligate den overlegne vena cava ved hjælp af en 8-0 silke sutur og opdele distalt.
- Gentag retrogradperfusionen ved at injicere yderligere 1,5 ml 4 °C saltvand via den ringere vena cava.
- Ligate den ringere vena cava ved hjælp af en 8-0 silke sutur og opdele distalt.
- Disseker aortabuen og lungearteriestammen til podningshøst og transekt begge distalt. Lign lungevenerne på hjertets bageste overflade ved hjælp af en 6-0 silkesutur og del distalt.
- Udfør transplantatforberedelse ved at fjerne donorhjertet fra brysthulen. Anbring det udskårne hjerte i en plastikbeholder fyldt med 4 °C hepariniseret saltvand i 1-2 min. Transplantatet overføres til en steril plastkolbe fyldt med is til manchetplacering (figur 1A).
BEMÆRK: Hjertetransplantatet skal forblive på kolben i ca. 5 minutter for at placere donorens lungearteriemanchet. - Anbring et 1 mm langt 20 G angiokateter (se Materialetabel) manchet over lungearterien til donormanchetten. Brug fine tang til forsigtigt at folde kanterne af arterien tilbage over manchetten. Fastgør det foldede kar til manchetten ved hjælp af et 10-0 nylonbånd, som beskrevet tidligere18 (figur 1B, C).
- Donorhjertet opbevares i hepariniseret saltvand eller en anden konserveringsopløsning ved 4 °C.
BEMÆRK: Mens nogle måske foretrækker specifikke bevaringsløsninger (f.eks. University of Wisconsin-løsningen) til langvarig iskæmisk konservering, kan det være dyrt19. Saltvand kan være et passende alternativ til korte perioder med iskæmi (<1 t)20. I sidste ende afhænger valget af bevaringsløsning af det eksperimentelle design21.
2. Procedure for modtagelse
- Injicer ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (8-10 mg/kg) intraperitonealt i modtagermusen til anæstesi. Buprenorphin med vedvarende frigivelse (0,5-1,0 mg/kg) injiceres subkutant til analgesi. Bekræft kirurgisk anæstesiplan med tå og hale knivspids.
- Forbered det kirurgiske område ved at barbere håret fra livmoderhalsområdet ved hjælp af en elektrisk barbermaskine. Påfør steril, ikke-medicinsk oftalmisk salve på øjnene for at forhindre hornhindetørring.
- Placer dyret i liggende stilling med forben ved siden af kroppen og hovedet drejet lidt til venstre. Fastgør forbenene og bagbenene med kirurgisk tape. Desinficer huden med tre skiftende skrubber af 0,75% jod og 70% ethanol.
- Lav et midterlinje cervikal snit fra den nederste mandible til brystbenet.
- Transect den højre sternocleidomastoid muskel. Skær den højre lap af den submandibulære kirtel for at skabe plads til graftimplantation.
- Bind en slipknot over den proksimale ydre jugular vene ved hjælp af en 6-0 silke sutur. Læg den distale ydre jugular vene og tilstødende grene ved hjælp af en 8-0 silke sutur. Lav et tværgående snit over den forreste væg af den ydre jugular vene.
- Placer en 10-0 nylonsutur gennem kanten af den proksimale ydre jugular vene og det underliggende væv for at fastgøre venen under manchetindsættelse (figur 1D).
- Ligate den distale højre fælles halspulsåre ved hjælp af en 8-0 silke sutur lige ringere end carotis bifurcation. Bind en slipknot over den proksimale fælles halspulsåre ved hjælp af en 6-0 silkesutur. Transect arterien distalt mellem suturerne.
- I lighed med donormanchetten skal du placere en 0,6 mm lang 24 G angiokatetermanchet over modtagerens højre fælles halspulsåre. Brug fine tang til forsigtigt at folde kanterne af arterien tilbage over manchetten. Fastgør det foldede fartøj til manchetten ved hjælp af et 10-0 nylonbånd.
- Placer donorhjertet bedre end det højre cervikale område.
- Dråbe koldt saltvand på hjertetransplantatet hvert par minutter under implantation.
- Placer en 10-0 nylonsutur gennem kanten af donor aorta og gennem et overfladisk bid af det underliggende væv for at sikre transplantatet på plads (figur 1E).
- Skyl donor aorta med 0,5 ml 0,9% hepariniseret saltvand.
- Indsæt modtagerens fælles halspulsåremanchet i donor aorta. Sikre anastomose med en 8-0 silkeslips (figur 1F). Fjern aortaankersuturen.
- Afluft den eksterne jugular vene ved at skylle modtagerens eksterne jugular vene med 0,5 ml 0,9% hepariniseret saltvand.
- Udfør lungearterieanastomose ved at indsætte donorens lungearteriemanchet i modtagerens ydre jugular vene og sikre med en 8-0 silke slips (figur 1G). Fjern den eksterne jugular vene anker sutur og transect den resterende bageste væg af den ydre jugular vene for at frigøre transplantatet fra det underliggende væv. Sørg for, at transplantatet er korrekt orienteret uden kinking eller vridning af anastomoserne.
- Slip slipknots på modtagerens ydre jugular vene efterfulgt af den fælles halspulsåre for at indlede hjertetransplantatreperfusion (figur 1H).
- Luk cervikal hudsnit ved hjælp af en afbrudt 6-0 nylonsutur.
3. Postoperativ pleje
- Anbring modtageren i et varmt genopretningskammer umiddelbart efter operationen og overvåg nøje, indtil den er helt genoprettet efter anæstesi (ca. 1 time).
- Fortsæt med nøje at overvåge dyret (hver 6-8 timer) i mindst 72 timer efter operationen for tegn på unormal adfærd, såsom sløvhed, rysten, hurtig vejrtrækning eller anoreksi.
- Til smertekontrol injiceres carprofen (5 mg/kg) subkutant hver 8-12 timer for analgesi ud over subkutan buprenorphin (0,05 mg/kg) hver 8-12 timer i 24-48 timer fra operationens afslutning.
4. Intravital to-fotonbilleddannelse af leukocythandel med hjertetransplantatet
- Injicer ketamin (80-100 mg/kg) og xylazin (8-10 mg/kg) intraperitonealt i en B6 LysM-GFP-modtagermus17 2 timer efter transplantatreperfusion til anæstesi.
- Udfør orotracheal intubation ved hjælp af et 20 G angiokateter, som tidligere beskrevet18.
- Tilslut angiokateteret til slanger fra en mekanisk ventilator til musen, og ventilér med rumluft med en hastighed på 120 vejrtrækninger/min og et tidevandsvolumen på 0,5 ml18.
- Der injiceres 12 μL 655 nm ikke-målrettede kvanteprikker (se Materialetabel), suspenderet i 50 μL PBS intravenøst, som tidligere beskrevet13.
- Åbn nakkesnittet igen for at udsætte hjertetransplantatet. Placer musen i et stabiliseringskammer.
- Fastgør en del af den frie væg i venstre ventrikel ved hjælp af en tynd ring af vævslim (se Materialebord), påført en glasdæksel, der er fastgjort til den øverste kammerplade.
- Placer kammeret under to-fotonmikroskopmålet for at erhverve billeder og videoer, som beskrevet tidligere13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne mus cervikal heterotopisk hjertetransplantationsmodel er blevet brugt til at udføre over 1.000 transplantationer i vores laboratorium med en overlevelsesrate på ca. 97%. Succesraten er lidt højere end tidligere rapporter ved hjælp af andre cervikale heterotopiske hjertetransplantationsteknikker hos mus10,11,20. Dette kan potentielt tilskrives den større 20 G manchet placeret på donorens lungearterie for at sikre rigelig tilbagevenden af blodgennemstrømningen til modtageren (figur 1B, C). Derudover minimerer justeringen af blodgennemstrømningen med manchetplacering i den nuværende teknik risikoen for trombose og anastomotisk turbulens (figur 1,2). Mens magnetisk resonansbilleddannelse (MR) eller ultralyd kunne vurdere turbulensen af graftperfusion22,23, har vi endnu ikke brugt disse teknikker i eksperimenterne. Intraoperativ død ved hjælp af denne teknik er sjælden for erfarne mikrokirurger. Postoperativ dødelighed skyldes oftest blødningskomplikationer. Den gennemsnitlige modtageroperationstid var 36,5 ± 3,5 min. med en gennemsnitlig kold iskæmitid på 20 min. Til overlevelsesundersøgelser blev hjertetransplantater vurderet dagligt ved direkte visualisering og digital palpation af hjerteslag. Mus ofres typisk til podningsevaluering omkring 7-14 dage postoperativt. Intravital to-fotonbilleddannelse er en terminal procedure, der normalt udføres tidligt efter transplantation for at evaluere leukocythandel (figur 3).
De fleste syngeneiske transplantationer opretholdt stærke hjerteslag indtil ofring, op til 6 måneder efter transplantationen. Ved grov inspektion syntes de fleste syngeneiske transplantater normale, og histologisk undersøgelse afslørede ingen tegn på afvisning. Alle ikke-immunsupprimerede allogene transplantationer (BALB/c til B6) udviklede et nedsat hjerteslag inden for 1-2 uger efter indkapsling. Udskårne allogene transplantater fra sådanne mus blev groft udvidet, og histologisk undersøgelse viste diffus infiltration af lymfocytter og områder med myokardienekrose.
Figur 1: Forberedelse af hjertetransplantat til transplantation . (A) Hjertet udskæres fra donormusen. (B,C) Lungearteriestammen udsættes og trækkes gennem en 20 G manchet, foldes tilbage og sikres med en 10-0 nylonsutur. (D) En 10-0 nylonsutur placeres gennem kanten af modtagerens ydre jugular vene og fastgøres til underliggende væv. (E) En 10-0 nylonsutur placeres gennem kanten af donor aorta og fastgøres til det underliggende væv, der støder op til modtagerens halspulsåre. (F) Modtagerens fælles halspulsåremanchet indsættes i donor aorta og sikres med en 8-0 silke sutur. (G) Donorens lungearteriemanchet indsættes i modtagerens ydre jugular vene og sikres med en 8-0 silke sutur. (H) Proksimal slipknude på modtagerens ydre jugular vene frigives, efterfulgt af frigivelse af den fælles halspulsåre slipknot. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Intraoperativ visning af hjertetransplantat. En 1 mm 20 G manchet trækkes over donorens lungearterie og sikres med et 10-0 nylonbånd. En 0,6 mm 24 G manchet trækkes over modtagerens højre fælles halspulsåre og fastgøres med et 10-0 nylonbånd. Ankersuturer (10-0 nylon) placeres i væggen på donor aorta og modtagerens højre ydre jugular vene og fastgøres til underliggende væv for at forhindre bevægelse under manchetindsættelse. (AO = aorta, PA = lungearterie, CCA = almindelig halspulsåre, EJV = ekstern jugular vene). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Intravital to-foton billeddannelse af leukocytdynamik i hjertetransplantatet. Intravital to-fotonbilleddannelse af bankende hjerte transplanteret fra B6-mus til B6 LysM-GFP-modtager demonstrerer handel med modtagerneutrofiler i hjertetransplantatvævet mellem 2-3 timer postoperativt. (Grøn = neutrofiler, rød = kar mærket med kvanteprikker). Skala bar = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Komplikation | Mulige årsager | Løsninger |
| Modtagerens død | Hypotermi | Varmepude |
| Dehydrering | 0,9% saltvand I.P. postoperativt | |
| Dårlig transplantatperfusion | Carotisarterie torsion | Re-anastomose, eller |
| Trombose eller luftemboli | Åbn arteriel anastomose og flush med hepariniseret saltvand | |
| Venøs obstruktion | Trombose eller luftemboli | Re-anastomose, eller |
| Åbn venøs anastomose og skyl med hepariniseret saltvand | ||
| Postoperativ blødning | Blødende jugular vene grene | Ligusterformede venegrene |
| Kompression af vatpind | ||
| Løse manchetter | Spænd manchetterne | |
| Svagt hjerteslag | Kold hjertetransplantat | Dråbe varm saltvand på overfladen af hjertet |
| Graft vridning | Forkert graftposition | Sørg for, at transplantatet er korrekt orienteret inden lukning af huden |
| Uregelmæssig aktivitet (f.eks. kører i cirkler) | Cerebral iskæmi | Likat fælles halspulsåre ringere end carotis bifurcation |
Tabel 1: Fejlfinding for komplikationer. Almindeligt forekommende komplikationer med løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af denne teknik kan mus heterotopisk cervikal hjertetransplantation udføres på mindre end 40 minutter af en erfaren mikrokirurg og på ca. 60 minutter af en mikrokirurg på indgangsniveau. Mens cervikal hjertetransplantation er blevet undersøgt i adskillige dyremodeller, forbliver en musemodel guldstandarden på grund af flere veldefinerede genetiske stammer, genetiske ændringsevner og tilgængeligheden af adskillige reagenser, herunder monoklonale antistoffer24. Den teknik, der er beskrevet her, giver en unik mulighed for overvågning efter transplantation, såsom elektrokardiografi eller intravital billeddannelse, herunder tofotonmikroskopi (figur 3) eller seriel ikke-invasiv PET-billeddannelse13,14,15,25. Denne metode giver en overfladisk placering for hjertetransplantatet, der er lettere at stabilisere til intravital billeddannelse, og dermed undgår den kompleksitet, der er forbundet med abdominal transplantationsmetoden på grund af den dybere placering af transplantatet og de omgivende abdominale organer. Desuden er denne teknik særlig nyttig i forbindelse med gentransplantation. Re-transplantationsmodeller repræsenterer kraftfulde værktøjer til at identificere residente celler i transplanterede hjertetransplantater, der formidler alloimmune reaktioner. Mens vi tidligere har brugt denne teknik i en musehjertetransplantationsmodel til at vurdere kortsigtede resultater, kan denne tilgang udvides i fremtidige eksperimenter for at udforske langsigtede resultater16. Til dette formål har de nuværende undersøgelser hidtil brugt en kort periode med kold iskæmi (ca. 20 min). Fremtidige undersøgelser kan undersøge effekten af langvarig kold eller varm iskæmi på kort- og langsigtede resultater for nærmere at efterligne klinisk transplantation.
Flere kritiske trin i denne teknik skal overvejes. Tidligere metoder involverer manchetindsættelse på den mindre ydre jugular vene i det store lumen i donorens lungearterie 6,8. Placeringen af den større manchet på donorens lungearterie for at etablere korrekt orientering med blodgennemstrømning gør det lidt vanskeligere at indsætte manchetten i den mindre ydre halsvene. Fastgørelse af kanten af venen til det underliggende væv og kun delvist indskæring af venens forreste væg letter manchetindsættelsen. Derudover kan manchetplacering på modtagerens fælles halspulsåre være ret udfordrende på grund af fartøjets lille kaliber. Som sådan har tidligere teknikker rapporteret brugen af mindre manchetter (f.eks. 26 G) til denne anastomose12. Den nuværende tilgang bruger dog en større 24 G manchet for at sikre tilstrækkelig transplantatperfusion, som vi mener kan tilbyde nogle overlevelsesfordele. Valg af større modtagermus kan hjælpe nybegyndere mikrokirurger. Ankersuturer fjernes efter reperfusion, og transplantatet er ikke fastgjort i en korrekt retning, som andre har beskrevet3. Det er derfor vigtigt at kontrollere, at transplantatet er korrekt placeret og orienteret inden cervikal hudlukning for at forhindre vridning eller vridning (tabel 1). Udskæring af den højre submandibulære kirtel udføres for at give tilstrækkelig plads til hjertetransplantatet og dermed undgå transplantatkompression efter hudlukning.
Modellen beskrevet her giver flere fordele. Ved at placere manchetterne på donorens lungearteriestamme og modtagerens fælles halspulsåre stemmer manchetorienteringen overens med blodgennemstrømningens retning. Dette mindsker sandsynligheden for turbulent strømning og dannelse af trombose. For det andet anvendes en større 20 G lungearteriemanchet for at sikre rigelig tilbagevenden af blodgennemstrømningen til modtageren. For det tredje placeres en større 24 G manchet på den fælles halspulsåre for at sikre tilstrækkelig perfusion af transplantatet. Endelig bruges 10-0 nylonankersuturer til at fastgøre transplantatet til underliggende væv og lette manchetindsættelse. Disse ændringer hjælper med at overvinde de tekniske udfordringer ved proceduren, forhindre anastomotisk turbulens og reducere postoperative komplikationer såsom trombosedannelse.
En vigtig begrænsning af alle musehjertetransplantationsmodeller er, at fysiologisk blodgennemstrømning ikke genoprettes gennem hjertets kamre. I stedet er disse modeller afhængige af cirkulation gennem koronarbeholderne. Konsekvenserne af dette retrograde strømningsmønster på transplantatets cellulære skade og immunrespons er ikke klart afgrænset; Det er dog muligt, at mekaniske forskydningskræfter som følge af denne ikke-fysiologiske cirkulation påvirker immunresponser. En kirurgisk model for hjertetransplantation hos mus, der genopretter fysiologisk blodgennemstrømning, er endnu ikke udviklet og vil kræve betydelige tekniske fremskridt. Det observeres, at en lille del af mus (<3%) oplever forbigående uregelmæssig adfærd (f.eks. Løb i cirkler) efter proceduren. Denne funktionsmåde varer ca. 1-2 timer før opløsning. I betragtning af at denne adfærd ikke observeres efter andre procedurer, der bruger det samme bedøvelsesregime, kan det være relateret til forbigående cerebral iskæmi på grund af blodgennemstrømningsændringer efter cervikal hjertetransplantation. Fuld bedring har fundet sted hos alle mus uden nogen kroniske underskud observeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
DK er støttet af National Institutes of Health tilskud 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review grant 1I01BX002730 og The Foundation for Barnes-Jewish Hospital.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 7718729 | |
| 0.75% Providone iosine scrub | Priority Care Inc | NDC 57319-327-0 | |
| 10-0 nylon suture | Surgical Specialties Corporation | AK-0106 | |
| 655-nm nontargeted Q-dots | Invitrogen | Q21021MP | |
| 70% Ethanol | Pharmco Products Inc | 111000140 | |
| 8-0 braided silk ties | Henry Schein Inc | 1005597 | |
| Adson forceps | Fine Science Tools Inc | 91127-12 | |
| BALB/c and C57BL/6 mice (6-8 weeks) | Jackson Laboratories | ||
| Bipolar coagulator | Valleylab Inc | SurgII-20, E6008/E6008B | |
| Carprofen (Rimadyl) injection | Transpharm | 35844 | |
| Carprofen (Rimadyl) oral chewable tablet | Transpharm | 38995/37919 | |
| Custom-built 2P microscope running ImageWarp acquisition software | A&B Software | ||
| Dumont no. 5 forceps | Fine Science Tools Inc | 11251-20 | |
| Fine vannas style spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15000-03 | |
| GraphPad Prism 5.0 | Sun Microsystems Inc. | ||
| Halsey needle holder | Fine Science Tools Inc | 91201-13 | |
| Halsted-Mosquito clamp curved tip | Fine Science Tools Inc | 91309-12 | |
| Harvard Apparatus mouse ventilator model 687 | Harvard Apparatus | MA1 55-0001 | |
| Heparin solution (100 U/mL) | Abraxis Pharmaceutical Products | 504031 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine (50 mg/kg) | Wyeth | 206205-01 | |
| Microscope—Leica Wild M651 × 6–40 magnification | Leica Microsystems | ||
| Moria extra fine spring scissors | Fine Science Tools Inc | 15396-00 | |
| Ohio isoflurane vaporizer | Parkland Scientific | V3000i | |
| Qdots | ThermoFisher | 1604036 | |
| S&T SuperGrip Forceps angled tip | Fine Science Tools Inc | 00649-11 | |
| S&T SuperGrip Forceps straight tip | Fine Science Tools Inc | 00632-11 | |
| Sterile normal saline (0.9% (wt/vol) sodium chloride | Hospira Inc | NDC 0409-4888-20 | |
| Sterile Q-tips (tapered mini cotton tipped 3-inch applicators) | Puritan Medical Company LLC | 823-WC | |
| Surflow 20 gauge 1/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | SR-OX2032CA | |
| Surflow 24 gauge 3/4-inch Teflon angiocatheter | Terumo Medical Corporation | R-OX2419CA | |
| ThermoCare Small Animal ICU System (recovery settings 3 L/min O2, 80 °C, 40% humidity) | Thermocare Inc | ||
| VetBond | Santa Cruz Biotechnology SC361931 | NC0846393 | |
| Xylazine (10 mg/kg) | Lloyd Laboratories | 139-236 |
References
- Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. A technique for heart transplantation in the rat. The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).
- Ono, K., Lindsey, E. S. Improved technique of heart transplantation in rats. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).
- Heron, I. A technique for accessory cervical heart transplantation in rabbits and rats. Acta Pathologica Microbiologica Scandinavica Section A Pathology. 79 (4), 366-372 (1971).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52 (6), 1099-1101 (1991).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51 (4), 896-898 (1991).
- Yu, Y., et al. Cuff anastomosis of both renal artery and vein to minimize thrombosis: a novel method of kidney transplantation in mice. Journal of Investigative Surgery. 35 (1), 56-60 (2022).
- Tomita, Y., et al. Improved technique of heterotopic cervical heart transplantation in mice. Transplantation. 64 (11), 1598-1601 (1997).
- Wang, Q., Liu, Y., Li, X. K. Simplified technique for heterotopic vascularized cervical heart transplantation in mice. Microsurgery. 25 (1), 76-79 (2005).
- Oberhuber, R., et al. Murine cervical heart transplantation model using a modified cuff technique. Journal of Visualized Experiments. (92), e50753 (2014).
- Ratschiller, T., et al. Heterotopic cervical heart transplantation in mice. Journal of Visualized Experiments. (102), e52907 (2015).
- Mao, X., Xian, P., You, H., Huang, G., Li, J. A modified cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation model. Journal of Visualized Experiments. (180), e63504 (2022).
- Li, W., et al. Intravital 2-photon imaging of leukocyte trafficking in beating heart. Journal of Clinical Investigation. 122 (7), 2499-2508 (2012).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Li, W., et al. Visualization of monocytic cells in regressing atherosclerotic plaques by intravital 2-photon and positron emission tomography-based imaging-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (5), 1030-1036 (2018).
- Li, W., et al. Lung transplant acceptance is facilitated by early events in the graft and is associated with lymphoid neogenesis. Mucosal Immunology. 5 (5), 544-554 (2012).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Krupnick, A. S., et al. Orthotopic mouse lung transplantation as experimental methodology to study transplant and tumor biology. Nature Protocols. 4 (1), 86-93 (2009).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513 (2019).
- Ma, Y., et al. Optimization of the cuff technique for murine heart transplantation. Journal of Visualized Experiments. (160), e61103 (2020).
- Latchana, N., Peck, J. R., Whitson, B., Black, S. M. Preservation solutions for cardiac and pulmonary donor grafts: a review of the current literature. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1143-1149 (2014).
- Hartley, C. J., et al. Doppler velocity measurements from large and small arteries of mice. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 301 (2), 269-278 (2011).
- Bovenkamp, P. R., et al. Velocity mapping of the aortic flow at 9.4 T in healthy mice and mice with induced heart failure using time-resolved three-dimensional phase-contrast MRI (4D PC MRI). MAGMA. 28 (4), 315-327 (2015).
- Wang, H.
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
