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Engineering

Microtensiomètre pour la visualisation en microscopie confocale d’interfaces dynamiques

Published: September 9, 2022 doi: 10.3791/64110
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, 2Department of Chemical Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

Ce manuscrit décrit la conception et le fonctionnement d’un microtensiomètre/microscope confocal pour effectuer des mesures simultanées de la tension interfaciale et de la rhéologie dilatationnelle de surface tout en visualisant la morphologie interfaciale. Cela fournit la construction en temps réel des relations structure-propriété des interfaces importantes en technologie et en physiologie.

Abstract

L’adsorption de molécules tensio-actives aux interfaces fluide-fluide est omniprésente dans la nature. Pour caractériser ces interfaces, il faut mesurer les taux d’adsorption des tensioactifs, évaluer les tensions superficielles d’équilibre en fonction de la concentration en vrac de tensioactifs et relier la façon dont la tension superficielle change avec les changements dans la zone interfaciale après l’équilibre. La visualisation simultanée de l’interface à l’aide de l’imagerie par fluorescence avec un microscope confocal à grande vitesse permet l’évaluation directe des relations structure-fonction. Dans le microtensiomètre à pression capillaire (CPM), une bulle d’air hémisphérique est épinglée à l’extrémité du capillaire dans un réservoir de liquide de volume de 1 mL. La pression capillaire à travers l’interface de bulle est contrôlée via un régulateur de débit microfluidique commercial qui permet un contrôle de la pression, de la courbure de bulle ou de la zone de bulle basé sur un modèle basé sur l’équation de Laplace. Par rapport aux techniques précédentes telles que l’auge de Langmuir et la goutte pendentive, la précision de mesure et de contrôle et le temps de réponse sont considérablement améliorés; les variations de pression capillaire peuvent être appliquées et contrôlées en quelques millisecondes. La réponse dynamique de l’interface à bulles est visualisée via une deuxième lentille optique à mesure que la bulle se dilate et se contracte. Le contour de la bulle est ajusté à un profil circulaire pour déterminer le rayon de courbure de la bulle, R, ainsi que tout écart par rapport à la circularité qui invaliderait les résultats. L’équation de Laplace est utilisée pour déterminer la tension superficielle dynamique de l’interface. Après l’équilibrage, de petites oscillations de pression peuvent être imposées par la pompe microfluidique contrôlée par ordinateur pour faire osciller le rayon de la bulle (fréquences de 0,001-100 cycles/min) pour déterminer le module dilatationnel Les dimensions globales du système sont suffisamment petites pour que le microtensiomètre passe sous la lentille d’un microscope confocal à grande vitesse permettant de suivre quantitativement les espèces chimiques marquées par fluorescence avec une résolution latérale submicronique.

Introduction

Les interfaces air-eau recouvertes de films tensioactifs sont omniprésentes dans la vie quotidienne. Les injections d’eau tensioactive sont utilisées pour améliorer la récupération du pétrole des champs épuisés et sont utilisées comme solutions de fracturation hydraulique pour le gaz et le pétrole de schiste. Les mousses gaz-liquides et les émulsions liquide-liquide sont communes à de nombreux procédés industriels et scientifiques en tant que lubrifiants et agents de nettoyage et sont courantes dans les aliments. Les tensioactifs et les protéines aux interfaces stabilisent les conformations d’anticorps pendant l’emballage, le stockage et l’administration 1,2,3,4,5, la stabilité du film lacrymal dans l’œil 6,7,8 et la mécanique pulmonaire 9,10,11,12,13,14, 15.

L’étude des agents tensioactifs ou des tensioactifs adsorbant les interfaces et de leurs propriétés a une longue histoire avec de nombreuses techniques expérimentales différentes 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Un développement récent est le microtensiomètre à pression capillaire (CPM), qui permet l’examen des propriétés interfaciales sur des interfaces très incurvées, à des échelles de longueur beaucoup plus petites, tout en utilisant beaucoup moins de matériaux que d’autres méthodes courantes 9,23,24,25. La microscopie confocale à fluorescence (CFM) peut être utilisée pour étudier la morphologie des lipides et des protéines aux interfaces air-eau dans le CPM22 ou sur les creux de Langmuir 20,26,27,28,29. Ici, un CPM et un CFM ont été combinés pour relier les phénomènes morphologiques aux propriétés interfaciales dynamiques et d’équilibre afin de développer des relations structure-fonction pour les interfaces biologiques et technologiques.

Il existe de nombreux paramètres importants dans les systèmes de tensioactifs interfaciaux accessibles au CPM-CFM. Dans le CPM, une bulle d’air de 30 à 200 μm de diamètre est épinglée à l’extrémité d’un tube capillaire en verre. Dans les versions antérieures du CPM, la différence de pression capillaire entre l’intérieur et l’extérieur de la bulle était contrôlée via une colonne d’eau et une pompe à seringue oscillatoire 9,30 ; la nouvelle version décrite ici les remplace par une pompe microfluidique de plus grande précision, contrôlée par ordinateur. La tension superficielle (γ) est déterminée par l’équation de Laplace, ΔP = 2γ/R, à partir de la chute de charge à travers l’interface définie par la pompe, ΔP, et l’analyse optique du rayon de courbure de la bulle, R. La tension superficielle dynamique de l’interface peut être déterminée avec une résolution temporelle de 10 ms suite à la génération d’une nouvelle bulle en contact avec un liquide en vrac contenant un tensioactif soluble. La dynamique d’adsorption du tensioactif peut être décrite par l’équation classiquede Ward-Tordai 10,31 pour déterminer les propriétés essentielles du tensioactif, y compris la diffusivité, la couverture de surface et la relation entre la concentration en vrac et la tension superficielle d’équilibre. Une fois qu’une tension superficielle d’équilibre est atteinte, la zone interfaciale peut être oscillée pour mesurer le module dilatationnel, Equation 1en enregistrant les changements de tension superficielle induits par de petits changements dans la surface de la bulle, A32. Pour les interfaces plus complexes qui développent leurs propres structures internes telles que des polymères ou des protéines intriqués, la tension superficielle, , est remplacée par une contrainte de surface plus générale 4,33, Equation 2.

La stabilité pulmonaire pendant la respiration peut être directement liée au maintien d’une faible tension superficielle et d’un module dilatationnel élevé à l’interface air-liquide alvéolaire 9,10. Toutes les surfaces pulmonaires internes sont tapissées d’un film continu de liquide de la muqueuse épithéliale d’épaisseur pour maintenir l’hydratation des tissus34. Ce liquide de la muqueuse épithéliale est principalement de l’eau, avec des sels et diverses autres protéines, enzymes, sucres et tensioactifs pulmonaires. Comme c’est le cas pour toute interface liquide-vapeur incurvée, une pression capillaire est induite avec la pression plus élevée à l’intérieur de l’alvéole (ou bulle). Cependant, si la tension superficielle était constante partout dans les poumons, l’équation de Laplace, ΔP = 2γ/R, montre que les alvéoles plus petites auraient une pression interne plus élevée par rapport aux alvéoles plus grandes, forçant les teneurs en gaz des alvéoles plus petites à s’écouler vers des alvéoles plus grandes et plus basses. C’est ce qu’on appelle « l’instabilité de Laplace »9,35. Le résultat net est que les plus petites alvéoles s’effondreraient et seraient remplies de liquide et deviendraient difficiles à regonfler, provoquant l’effondrement d’une partie du poumon, et d’autres parties se gonfleraient à l’excès, deux symptômes typiques du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Cependant, dans un poumon qui fonctionne correctement, la tension superficielle change dynamiquement à mesure que l’interface air-liquide épithélial dans la zone interfaciale alvéole se dilate et se contracte pendant la respiration. Si Equation 3, ou Equation 4, la pression de Laplace diminue avec un rayon décroissant et augmente avec un rayon croissant de manière à éliminer l’instabilité de Laplace, stabilisant ainsi le poumon9. Par conséquent, Equation 5, et comment cela dépend de la fréquence, de la morphologie et de la composition de la monocouche, et de la composition du liquide alvéolaire peut être essentiel pour la stabilité pulmonaire. Le CPM-CFM a également fourni les premières démonstrations des effets de la courbure interfaciale sur l’adsorption du tensioactif25, la morphologie monocouche22 et le module dilatationnel9. Le petit volume (~1 mL) du réservoir dans le CPM permet l’introduction, l’élimination ou l’échange rapide de la phase liquide et minimise la quantité requise de protéines ou de tensioactifs coûteux10.

Le contraste dans une image CPM-CFM est dû à la distribution de petites fractions de lipides ou de protéines marqués par fluorescence à l’interface16,27. Les monocouches de tensioactifs bidimensionnels présentent souvent une séparation de phase latérale en fonction de la tension superficielle ou de la pression superficielle, Equation 6 π est la différence entre la tension superficielle d’une interface fluide-fluide propre, γ 0, et une interface recouverte de tensioactif, γ. π peut être considérée comme la « pression » 2D causée par les interactions des molécules de tensioactif à l’interface qui agit pour abaisser la tension superficielle du fluide pur. À basse pression de surface, les monocouches lipidiques sont dans un état désorganisé semblable à un liquide; c’est ce qu’on appelle la phase d’expansion liquide (LE). Au fur et à mesure que la pression de surface augmente et que la surface par molécule lipidique diminue, les lipides s’orientent les uns avec les autres et peuvent subir une transition de phase de premier ordre vers la phasecondensée liquide ordonnée (LC) à longue distance 16,20,27. Les phases LE et LC peuvent coexister à différentes pressions de surface et peuvent être visualisées comme des lipides marqués par fluorescence sont exclus de la phase LC et se séparent de la phase LE. Ainsi, la phase LE est lumineuse et la phase LC est sombre lorsqu’elle est imagée avec CFM16.

Le but de ce manuscrit est de décrire les étapes nécessaires à la construction et à l’exploitation du microtensiomètre combiné du microscope confocal. Cela permettra au lecteur d’effectuer des études d’adsorption, de mesurer la tension superficielle, le comportement rhéologique et d’examiner simultanément la morphologie interfaciale sur une interface air/eau ou huile/eau à l’échelle du micron. Cela comprend une discussion sur la façon de tirer, couper et hydrophober les capillaires requis, des instructions pour l’utilisation des modes de contrôle de la pression, de la courbure et de la surface, et le transfert interfacial de tensioactif insoluble à l’interface incurvée du microtensiomètre.

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Protocol

1. Préparation des tubes capillaires

  1. Placez le capillaire dans un extracteur capillaire et exécutez le programme de traction souhaité pour fabriquer deux capillaires coniques d’un diamètre extérieur (OD) d’environ 1 μm à la pointe.
    REMARQUE: L’OD du capillaire avant de tirer doit être le OD spécifié pour s’adapter au support capillaire dans la cellule du microtensiomètre. Le diamètre intérieur (ID) du capillaire peut varier, mais affectera le rayon critique du capillaire après la traction. Un programme de traction est choisi de sorte que la conicité résultante réduise d’abord rapidement l’OD capillaire et l’ID, puis atteigne un rayon proche de l’OD et de l’ID capillaires souhaités, puis réduise le diamètre plus lentement. Cela créera une plus grande longueur capillaire qui peut être notée pour donner un capillaire utilisable de 30-100 μm en ID.
  2. Marquez la pointe du capillaire à l’endroit souhaité pour obtenir un ID de 30-100 μm et cassez la pointe. Le capillaire aura maintenant un OD et un ID du rayon souhaité à l’extrémité (Figure 1A). Les capillaires peuvent être stockés jusqu’à l’étape 2.
    REMARQUE: Le bord coupé du capillaire doit être une cassure propre de 90 °. Tout défaut dans le bord coupé entraînera une mauvaise épinglage de la bulle au capillaire et de mauvaises mesures des propriétés de surface. Les pointes capillaires effilées sont très délicates. Ils seront détruits s’ils entrent en contact avec autre chose que les solutions (p. ex., parois du flacon, buse d’air).

2. Hydrophobisation des capillaires

  1. Rassemblez les capillaires en verre tirés, la solution de nettoyage acide, les pinces à épiler en plastique, l’eau désionisée (DI), la solution d’hydrophobisation (2% de silane dans l’éthanol), la pompe à vide et la solution d’éthanol. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails.
    ATTENTION: La solution de nettoyage acide est toxique, provoque une corrosion / irritation de la peau et des yeux, est oxydante. La solution d’hydrophobisation est un irritant pour la peau, les yeux et les voies respiratoires. Portez une protection oculaire, des blouses de laboratoire et des gants et travaillez avec des solutions dans une hotte aspirante.
  2. Nettoyez le capillaire à l’acide
    REMARQUE: Le nettoyage à l’acide du capillaire élimine tous les résidus organiques à l’intérieur du capillaire et prépare la surface du verre à la réaction de silanisation qui rend le capillaire hydrophobe.
    1. Attrapez un capillaire fermement près de son extrémité large avec la pince à épiler.
    2. Trempez la pointe effilée dans la solution de nettoyage acide tout en fixant le tuyau de la pompe à vide à l’extrémité large du capillaire. Cela aspirera la solution dans le capillaire.
      REMARQUE: Une pointe de pipette peut être fixée à l’extrémité du tuyau capillaire pour permettre un meilleur ajustement avec l’extrémité capillaire.
    3. Arrêtez lorsque la solution de nettoyage acide a rempli environ la moitié du capillaire.
      REMARQUE: Après avoir retiré la pointe capillaire de la solution de nettoyage acide, la solution à l’extérieur du capillaire forme souvent une perle près de la pointe capillaire. Touchez doucement le capillaire jusqu’au cou du flacon de solution pour éliminer l’excès de solution.
    4. Laissez la solution de nettoyage acide rester dans les capillaires pendant au moins 30 minutes, en veillant à ce que le bouchon du liquide reste à l’extrémité effilée du capillaire.
    5. Retirez la solution de nettoyage acide du capillaire en tenant fermement le capillaire avec la pince à épiler et en utilisant le tuyau d’aspiration pour extraire le liquide de la grande extrémité du capillaire.
  3. Rincer le capillaire
    1. Immergez l’extrémité effilée du capillaire dans l’eau DI en vous assurant qu’elle est immergée assez profondément pour couvrir tout extérieur qui a été immergé dans la solution de nettoyage acide. Pendant que la pointe est immergée, utilisez le tuyau d’aspiration pour tirer l’eau DI à travers le capillaire. Retirez le capillaire de l’eau et retirez l’eau restante avec le tuyau d’aspiration.
    2. Répétez l’étape ci-dessus au moins 4x.
  4. Effectuez à nouveau l’étape 2.3 en remplaçant l’éthanol par de l’eau DI.
  5. Appliquer l’aspiration en continu jusqu’à ce que l’éthanol s’évapore complètement de l’intérieur du capillaire. Le capillaire deviendra trouble et frais au toucher au fur et à mesure que l’éthanol commencera à s’évaporer, mais disparaîtra après 30 à 45 s.
  6. Enduire le capillaire avec la solution d’hydrophobisation
    1. Trempez brièvement l’extrémité large du capillaire dans le silane à ~ 2% dans la solution d’éthanol. L’action capillaire fera monter la solution de revêtement dans le capillaire. Retirez le capillaire de la solution une fois qu’un bouchon de taille ~ 1 cm s’est élevé dans le capillaire.
    2. Orientez le capillaire de manière à ce que la pointe effilée soit orientée vers le bas, ce qui permet à la solution de revêtement de tomber par gravité vers la pointe effilée.
    3. Laisser la solution de revêtement rester dans le capillaire pendant au moins 3 min.
      REMARQUE: Il ne doit pas y avoir de bulles d’air dans le bouchon de la solution de revêtement qui est en contact avec l’intérieur de la pointe effilée. S’il y a une bulle d’air, l’intérieur capillaire n’a probablement pas été suffisamment séché à l’étape 2.5. Pour y remédier, répétez les étapes 2.4 à 2.6 au besoin.
  7. Rincez les capillaires avec de l’éthanol 1x de la même manière que l’étape 2.3.
  8. Réglez le revêtement hydrophobe sur le capillaire
    1. Placez les flacons de scintillation propres et secs dans un four à vide réglé à 120 °C. Placez les capillaires enduits dans les flacons (idéalement un capillaire par flacon) avec de larges extrémités reposant sur la base du flacon. Laisser les capillaires rester au four pendant au moins 6 h (de préférence pendant la nuit) pour obtenir une liaison permanente de la couche de silane hydrophobe aux capillaires. Les capillaires peuvent être stockés jusqu’à l’étape 4.

3. Préparation et stockage des échantillons

  1. Mélanger et stocker les solutions de tensioactifs et de fluorophores dans des flacons propres lavés à l’acide pour éviter toute contamination.
    REMARQUE: Les lipides disponibles dans le commerce doivent être de la plus haute pureté et stockés entre les utilisations à - 20 ° C. Les lipides anciens ou contaminés rendent souvent les résultats difficiles à reproduire.

4. Configuration du microtensiomètre

  1. Assemblez la cellule CPM comme décrit à la figure 2.
    1. Placez le grand côté du capillaire dans le haut de la cellule CPM jusqu’à ce qu’il pousse à travers la face inférieure de la cellule.
    2. Serrez doucement le bouchon en PEEK pour fixer le capillaire, puis fixez le tube de la pompe microfluidique au grand côté du capillaire. Veillez à ne pas toucher la pointe capillaire effilée.
  2. Si nécessaire, fixez les tuyaux d’échange de réservoir et/ou de contrôle de la température aux entrées et sorties respectives de la cellule CPM (Figure 2); sinon, branchez les entrées et les sorties inutilisées.
  3. Fixez la cellule CPM à l’étage du microscope confocal, en l’alignant grossièrement avec l’objectif CFM, la caméra CPM et la source lumineuse CPM (Figure 3).
  4. Ouvrez le débit de gaz vers la pompe microfluidique à la pression de fonctionnement recommandée de la pompe (150 mbar pour la pompe microfluidique utilisée ici) et assurez-vous que le débit vers le capillaire est ouvert.
  5. Commencez à exécuter l’interface virtuelle CPM (Fichier de codage supplémentaire 1 : Microtensiomètre virtuel Interface.vi) en mode Contrôle de pression avec la fréquence et l’amplitude d’oscillation de la pression capillaire réglées sur zéro (Figure 4-7). La figure 4 montre une capture d’écran de l’interface virtuelle. Pour l’eau DI et un rayon capillaire d’environ 35 μm, une pression d’environ 20 mbar garantit qu’aucune eau ne pénètre dans le capillaire.
  6. Remplissez la cellule CPM avec de l’eau à l’aide d’une pipette.
  7. Concentrez-vous sur la pointe capillaire à l’aide de la caméra microtensiomètre.
  8. Concentrez-vous sur la pointe capillaire avec le CFM. S’il est difficile de trouver le capillaire, utilisez la caméra CPM pour trouver l’objectif CFM. Cela aidera à approximer la distance entre l’objectif CFM et la bulle, en atteignant la distance de travail correcte.
  9. Une fois que l’anneau (projection du secteur vert) est centré sur la bulle, ajustez manuellement la mise au point afin que le bord de la bulle puisse être vu clairement (Figure 4-3).
    REMARQUE: La position, l’angle de début et de fin et les rayons intérieurs et extérieurs de l’anneau peuvent être ajustés via le menu situé sous la fenêtre de vue.
  10. Cliquez sur Réinitialiser la bulle et assurez-vous qu’une nouvelle bulle est formée (on pourra entendre l’ancienne bulle éclater, et la nouvelle bulle sera observable à partir de la fenêtre de visualisation du panneau de configuration; Figure 4-3). Si la bulle n’apparaît pas, augmentez la pression de réinitialisation ou augmentez le délai de réinitialisation dans l’onglet Réinitialisation de la bulle sous la fenêtre d’affichage. Vérifiez si la tension superficielle est d’environ 73 mN/m (pour les bulles salines ou d’eau/air) (Figure 4-9).
  11. Retirez l’eau à l’aide de la seringue directe à la cellule (Figure 3-13), videz-la et rattachez-la. L’exemple est prêt à être chargé pour exécuter l’expérience.

5. Étude d’adsorption

  1. Remplissez la cellule avec l’échantillon souhaité à l’aide d’une pipette autoclavée en maintenant le logiciel CPM en mode contrôle de pression . Assurez-vous que la tension superficielle initiale est d’environ 73 mN/m lorsqu’une nouvelle interface à bulles est créée.
  2. Déterminez le rayon de la bulle nouvellement formée et entrez cette valeur dans le contrôle de zone de ligne médiane (Figure 4-7) et remplacez le type de contrôle par contrôle de zone en cliquant sur l’onglet Contrôle de zone (Figure 4-8).
    REMARQUE: Un contrôle de pression constant peut également être utilisé, mais cela provoque un changement continu du rayon de la bulle à mesure que la tension superficielle de l’interface change. Cette zone changeante peut compliquer l’analyse des taux d’adsorption des tensioactifs et provoquer l’éclatement de la bulle pendant l’étude.
  3. Commencez à enregistrer la vidéo confocale.
  4. Cliquez sur Réinitialiser la bulle (Figure 4-5) et cliquez immédiatement sur Collecter les données (Figure 4-6). Le voyant de signalisation sur le bouton devient vert.
  5. Ajustez le taux d’enregistrement des données en fonction de la concentration de l’échantillon en faisant glisser la barre illustrée à la figure 4-6. Pour des adsorptions plus lentes, utilisez un taux d’enregistrement plus lent. Cela peut être ajusté au milieu d’une exécution si un taux d’enregistrement plus élevé est souhaité dès le début, mais un taux plus lent est préférable pour les études longues afin de réduire la taille du fichier.
  6. Après la fin de l’expérience (lorsqu’un plateau de tension superficielle final a été atteint), enregistrez le fichier en choisissant le chemin de fichier correct (Figure 4-1) et en cliquant sur le bouton Enregistrer (Figure 4-2).
  7. Arrêtez et enregistrez également l’enregistrement sur le CFM.

6. Étude d’oscillation/relaxation

  1. Remplissez la cellule avec l’échantillon à l’aide d’une pipette autoclavée en maintenant le logiciel CPM en mode contrôle de pression . Assurez-vous que la tension superficielle est d’environ 73 mN/m lorsqu’une nouvelle interface à bulles est créée.
  2. Attendez que l’échantillon soit complètement adsorbé dans l’interface. Cela peut être effectué directement après une étude d’adsorption au lieu de recommencer avec une nouvelle interface à bulles.
  3. Décidez si l’oscillation sera une oscillation de pression, une oscillation de surface ou une oscillation de courbure en sélectionnant l’onglet approprié (Figure 4-8) et en entrant la valeur de référence souhaitée, le pourcentage d’oscillation et la fréquence d’oscillation (Figure 4-7).
    REMARQUE: Les oscillations en dents de scie, carrées et triangulaires de la zone d’onde sont également accessibles à partir du menu déroulant de l’onglet Autre oscillation de zone .
  4. Démarrez l’enregistrement de la vidéo confocale et cliquez sur Collecter les données (Figure 4-6) sur le logiciel CPM.
  5. Démarrez l’oscillation. Assurez-vous d’enregistrer au moins sept cycles pour de meilleurs résultats. Choisissez un taux d’acquisition de données (Figure 4-6) pour donner un nombre adéquat de points de données pour chaque cycle d’oscillation.
  6. Si d’autres amplitudes ou fréquences d’oscillation sont souhaitées, modifiez les valeurs pendant l’expérience.
  7. Enregistrez les résultats comme dans les étapes 5.6 et 5.7.

7. Étude d’échange de solvants

  1. Remplissez la cellule avec l’échantillon à l’aide d’une pipette autoclavée en maintenant le logiciel CPM en mode de contrôle de la pression. Assurez-vous que la tension superficielle est d’environ 73 mN/m, lorsqu’une nouvelle interface à bulles est créée.
    REMARQUE : Des études d’adsorption et/ou d’oscillation peuvent être effectuées avant l’étude d’échange de solvants.
  2. Raccordez le tube d’entrée avec la bouteille de la solution d’échange souhaitée (Figure 3-11) à la pompe péristaltique (Figure 3-10).
  3. Démarrez l’enregistrement de la vidéo dans un logiciel confocal et cliquez sur Collecter des données (Figure 4-6) sur le logiciel CPM.
  4. Réglez la vitesse de la pompe péristaltique. Cela permettra de contrôler le taux d’échange de fluide et doit être choisi en fonction des exigences de l’expérience, c’est-à-dire de la vitesse à laquelle le solvant doit être échangé.
  5. Si plusieurs fluides doivent être échangés, arrêtez la pompe péristaltique et connectez l’entrée à une autre solution d’échange.
  6. Une fois l’échange terminé (~20 min), enregistrez les résultats comme aux étapes 5.6 et 5.7.

8. Adsorption de tensioactif insoluble

REMARQUE: Si le tensioactif à adsorber n’est pas soluble dans le liquide réservoir, cette méthode peut être utilisée pour transférer une monocouche de l’interface air/eau de la cellule à la surface de la bulle. De nombreux lipides formant des bicouches sont presque insolubles dans une solution saline et n’absorbent pas spontanément dans la bulle lorsqu’ils sont en suspension dans la solution réservoir.

  1. Remplissez la cellule avec l’échantillon à l’aide d’une pipette autoclavée en maintenant le logiciel CPM en mode contrôle de pression . Assurez-vous que la tension superficielle est d’environ 73 mN/m, lorsqu’une nouvelle interface à bulles est créée.
  2. Déposer une monocouche de tensioactif insoluble sur l’interface air-eau de la cellule à partir d’une solution dans une solution organique volatile. À l’aide d’une seringue, déposez de petites gouttelettes à l’interface et laissez le solvant s’évaporer en laissant le lipide sous forme de film mince.
    ATTENTION: Le chloroforme est utilisé comme solvant pour les phospholipides tels que la phosphatidylcholines et les acides gras. Les solutions d’épandage sont généralement de 0,01 à 0,02 mg de lipide par mL de solvant. Le chloroforme est extrêmement toxique, peut causer une irritation de la peau et des yeux et est cancérigène. Portez une protection oculaire, une blouse de laboratoire et des gants appropriés et fabriquez la solution dans une hotte aspirante.
  3. Diminuez la surface via le contrôle de pression de la ligne médiane (Figure 4-7) de la bulle jusqu’à ce qu’elle soit presque plate. Cela empêche la bulle d’éclater après l’adsorbation du tensioactif.
  4. Retirez le liquide réservoir de la cellule via la seringue directe à la cellule jusqu’à ce que l’interface air/eau passe au-delà de l’extrémité du capillaire. Bien qu’une pompe à seringue puisse être utilisée, cette étape peut être réalisée en utilisant manuellement la seringue.
  5. Augmentez la hauteur du liquide du réservoir à son niveau initial.
    REMARQUE: Une fois la pointe resoubmergedée, la bulle sera plus grande en raison du tensioactif qui est maintenant adsorbé sur l’interface. La monocouche sera maintenant prête pour des expériences d’oscillation ou d’échange de solvants.

9. Nettoyer

  1. Éteignez le CFM.
  2. Passez en mode contrôle de la pression .
  3. Retirez l’échantillon de la cellule à l’aide d’une pipette. Chargez la cellule avec de l’eau DI et augmentez la pression à ~ 50 mbar pour que les bulles s’échappent constamment du capillaire et nettoient la pointe capillaire. Répétez ce processus 2x.
  4. Fermez la soupape de sécurité et éteignez le CPM en cliquant sur le bouton rouge dans le coin supérieur gauche, éteignez le panneau de commande de pression bleu et lumineux et fermez la source de pression.
  5. Retirez la cellule de l’étage du microscope confocal. Rincez la cellule avec de l’éthanol et de l’eau DI. Retirez le tube capillaire de la cellule CPM.

10. Nettoyage de la cellule

  1. Démontez la cellule. Brossez le mur intérieur avec une brosse à dents tout en rinçant sous l’eau DI. Immergez les pièces dans de l’éthanol et soniquez-les pendant environ 30 min.
  2. Rincez toutes les pièces avec de l’eau DI plusieurs fois. Séchez les pièces en les soufflant avec de l’azote gazeux ou en les séchant à l’intérieur d’un four à vide.

11. Analyse des oscillations

  1. Exécutez le code Dilatational_Rheology_Analysis.m (fichier de codage supplémentaire 2), en choisissant le fichier souhaité enregistré à partir de l’interface virtuelle CPM. Des exemples de données sont inclus dans les fichiers supplémentaires.
  2. Le graphique pression vs temps apparaîtra comme illustré à la figure supplémentaire 1. Cliquez avec le bouton gauche de la souris sur le point où commence l’oscillation et cliquez à nouveau avec le bouton gauche de la souris à l’endroit où l’oscillation se termine. Si les données contiennent plusieurs oscillations, répétez ce processus pour toutes les oscillations.
    1. Lorsque tous les points de début et de fin ont été cliqués avec le bouton gauche, cliquez avec le bouton droit de la souris n’importe où. Par exemple, comme le montre la figure supplémentaire 1, on peut cliquer avec le bouton gauche aux points 1, 2, 3 et 4, suivi d’un clic droit.
      REMARQUE: Le code calculera le module de dilatation et l’angle de phase et les résultats seront écrits dans un nouveau fichier .csv à l’emplacement du fichier d’origine. Les résultats des exemples de données sont visibles dans les résultats du code fournis dans le fichier de codage supplémentaire 2. MATLAB générera également plusieurs représentations graphiques des données, comme illustré à la figure supplémentaire 2.

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Representative Results

Une source majeure d’erreur de mesure provient des capillaires qui présentent des défauts provenant soit du processus de coupe (Figure 5A, B), soit du processus de revêtement (Figure 5D). Les deux types de défauts entraînent des erreurs dans la détermination de la forme et de la taille de la bulle par le système d’analyse d’image optique, ce qui conduit à des valeurs de tension superficielle inexactes. Il est important d’examiner attentivement chaque nouveau capillaire après qu’il a été tiré et enduit sous le microscope optique avant d’insérer le capillaire dans le CPM. Un capillaire mal coupé doit être jeté, mais un capillaire mal enduit peut être nettoyé à l’acide et recouvert à nouveau pour améliorer l’épinglage de bulles à la fin du capillaire (étape 2 du Protocole). Les capillaires fonctionnent mieux si la coupe d’extrémité est parfaitement perpendiculaire au capillaire (Figure 5C) et les goupilles à bulles directement à l’extrémité du capillaire (Figure 5E). Le revêtement hydrophobe sur le capillaire deviendra moins efficace pour épingler avec l’utilisation, ce qui nécessitera que le capillaire soit nettoyé et recouvert à nouveau.

Des données représentatives de l’adsorption des tensioactifs par rapport au temps sont présentées à la figure 6. Les techniques expérimentales antérieures telles qu’un pendentif ou des gouttes sessiles utilisées pour mesurer l’adsorption des tensioactifs n’avaient pas de mécanisme permettant d’ajuster dynamiquement la pression capillaire car le changement de tension superficielle provoque un changement de la zone de bulle pendant l’adsorption 30,36,37. En fait, pour les bulles et les gouttes plus grandes, des changements dans la forme de la bulle ou de la goutte (et donc de la surface) sont nécessaires pour déterminer la tension superficielle à partir de l’analyse de la forme de l’interface, car la pression capillaire n’est pas mesurée indépendamment et la pression capillaire varie sur la surface de la goutte ou de la bulle37. Cela complique également l’analyse de l’adsorption car à mesure que le tensioactif s’adsorbe sur l’interface, la tension superficielle diminue, et pour satisfaire l’équation de Laplace, la surface de la bulle doit augmenter, nécessitant un surfactant supplémentaire pour s’adsorber pour atteindre l’équilibre. Dans le CPM, une pression capillaire fixe exige que le rayon initial de la bulle soit dans une petite plage avant l’adsorption du tensioactif pour empêcher la bulle de s’éjecter du capillaire si la tension superficielle diminue trop. La dynamique d’adsorption des tensioactifs est souvent modélisée par l’équation classique de Ward-Tordai31, qui décrit l’adsorption des molécules de tensioactifs dans une interface propre de zone interfaciale constante. Bien que l’équation de Ward-Tordai puisse être modifiée pour tenir compte de la surface changeante, cela introduit des paramètres supplémentaires et complique grandement l’analyse38,39.

Pour surmonter ces problèmes, une boucle de rétroaction basée sur un modèle a été développée à l’aide de l’équation de Laplace qui maintient la courbure (et la surface) de la bulle constante tout au long du processus d’adsorption en ajustant dynamiquement la pression capillaire. Il existe des différences significatives dans le taux de changement de la tension superficielle car la surface de la bulle n’augmente pas constamment. Les changements dans la zone de la bulle pendant l’adsorption ne sont pas constants avec le temps car la tension superficielle change lentement au début, puis accélère rapidement avant l’équilibrage. Une complication supplémentaire est que le changement fractionnaire dans la zone dépend du rayon initial de la bulle. Un avantage supplémentaire du rayon de bulle constant est que l’imagerie de l’interface est simplifiée car la surface de la bulle reste fixe, ce qui simplifie la mise au point du CFM. Pendant le processus d’adsorption, à mesure que le tensioactif s’adsorbe sur l’interface (vidéo 1), le signal fluorescent de l’interface augmente. Si le tensioactif forme des domaines de surface, on peut observer ces domaines se former et croître22.

Les variations de la tension superficielle pendant les oscillations de surface sont illustrées à la figure 7. Dans les versions précédentes du CPM, des oscillations étaient faites dans la pression capillaire à bulles; cependant, la génération d’une onde sinusoïdale en pression capillaire ne se traduit pas directement par une onde sinusoïdale en surface car les deux sont liés via l’équation de Laplace. En tirant parti d’une boucle de rétroaction basée sur un modèle utilisant l’équation de Laplace, des oscillations sont créées dans la zone plutôt que dans la pression capillaire, ce qui conduit à des données plus faciles à analyser et à collecter sur une plus grande gamme d’amplitudes. En conséquence, les données de tension superficielle par rapport à la surface recueillies à partir de cette méthode peuvent être utilisées pour calculer directement le module dilatationnel interfacial de la couche de tensioactif: Equation 7 (Figure 8), où Equation 8 est la contrainte totale du système et lacontrainteτest la contrainte déviante non isotrope souvent absente dans les solutions de tensioactifs simples 4,33. Ainsi, pour un système de tensioactif simple, Equation 9. Pour les interfaces où des réseaux élastiques peuvent être formés, comme les protéines tensioactives, des contraintes supplémentaires sont souvent présentes et doivent donc être prises en compte lors de la définition du module de dilatation. La vidéo 2 montre une vidéo CFM du mouvement des domaines LC noirs dans une matrice de phase LE colorée continue dans des monocouches de phospholipides. Les domaines LC distincts sur l’interface se réorganisent en un réseau de branchement qui couvre l’interface lorsque des oscillations ont lieu sur la bulle incurvée22,40. L’onglet Autres oscillations de zone peut être utilisé pour créer des ondes en dents de scie, carrées et triangulaires, comme illustré à la figure supplémentaire 3, et l’onglet Compression permet une compression et une expansion de zone à taux constant.

Pour les études d’échange de solvants, un tensioactif est d’abord autorisé à s’adsorber sur l’interface, puis le liquide réservoir est échangé pour permettre à une deuxième espèce tensioactive d’entrer en contact avec cette interface. Il est possible d’examiner le changement de tension superficielle car le deuxième tensioactif est en concurrence avec le tensioactif d’origine à l’interface. Le module dilatationnel de surface est souvent une sonde plus sensible de l’échange de tensioactifs avec la morphologie de surface via CFM. La figure 9 montre le changement de tension superficielle, de module de dilatation de surface et de morphologie de surface lorsqu’un tel échange de solvant a lieu. Bien que les spécificités d’un tel échange puissent varier, une modification de l’une des trois propriétés pourrait indiquer l’intégration du deuxième composant dans la monocouche ou la solvatation du composant primaire dans le vrac. Une deuxième étiquette fluorescente pourrait être attachée à l’espèce secondaire pour observer son interaction avec l’interface à partir des images CFM.

Figure 1
Figure 1 : Traitement capillaire. (A) Image montrant la notation du capillaire. La céramique de pointage du verre est maintenue dans une pince pour la maintenir stable. B) Nettoyage à l’acide du capillaire. La solution de nettoyage acide est tirée dans le capillaire avec la pompe à vide. (C) Hydrophobisation du capillaire. Bouchon de solution Silane maintenu à l’intérieur du capillaire Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Construction de la cellule. (1) Grand support de cellule en aluminium, (2) joint en fluoroélastomère (quatre au total), (3) glissière en verre (deux au total), (4) cellule PEEK et (5) petit support de cellule en aluminium. Une fois assemblé, un joint en fluoroélastomère est placé de chaque côté de chaque lame de verre. La cellule est maintenue ensemble avec des vis et des boulons. L’image zoomée de la cellule PEEK montre l’emplacement des différents ports : (6) port capillaire, (7) entrée d’échange de solvant, (8) sortie d’échange de solvant et (9,10) entrée et sortie de la gaine de contrôle de la température. Un bouchon en PEEK peut être utilisé pour fixer le tube ou le capillaire à la cellule. Les ports qui ne sont pas utilisés peuvent être complètement fermés par des prises sans canaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma du CPM/CFM, pas à l’échelle. (1) la cellule CPM, (2) le tube capillaire avec une bulle à l’extrémité, (3) l’objectif du microscope confocal, (4) l’objectif de la caméra du microscope avec filtre, (5) la source lumineuse CPM, (6) la pompe microfluidique, (7) la soupape de sécurité, (8) l’entrée d’échange de fluide, (9) la sortie d’échange de fluide, (10) la pompe péristaltique, (11) le réservoir de liquide d’échange, (12) les déchets d’échange de fluide, (13) directement à la seringue cellulaire, (14) entrée et sortie de la gaine de contrôle de la température, et (15) réservoir et pompe à température contrôlée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Interface virtuelle CPM. (1) le chemin d’accès au fichier où les données seront enregistrées ; (2) les paramètres système, les commentaires et le bouton Enregistrer. Tous les champs de cette zone sont enregistrés dans le fichier de données final; 3° l’image de la caméra CPM; (4) les paramètres contrôlant l’analyse de l’image, la mesure de l’anneau, la réinitialisation des bulles et le suivi des images par seconde; (5) le bouton Bubble Reset; (6) le bouton Collecter les données, le contrôle du taux d’enregistrement des données et les indicateurs de collecte des données; (7) les commandes pour toutes les valeurs d’axe du mode de fonctionnement, l’amplitude d’oscillation et la fréquence d’oscillation; (8) commutateur de mode de fonctionnement: en cliquant sur chaque onglet, vous passez à ce mode de contrôle. Chaque mode affiche le signal de pression envoyé à la pompe dans le graphique « Signal de pression » ainsi que quelques commandes supplémentaires; 9° les données de tension superficielle en direct; 10° les données de pression sous tension; 11° les données en temps réel sur le rayon de courbure; 12° les données de surface en direct; et (13) les données de tension superficielle et de surface en direct, qui peuvent être utilisées pour déterminer approximativement l’angle de phase au cours d’une étude d’oscillation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Défauts capillaires. (A) et (B) Capillaires mal coupés; (C) capillaire correctement coupé, (D) capillaire avec mauvais épinglage dû à un revêtement médiocre ou dégradé, et (E) capillaire correctement épinglé. Les flèches rouges en D et E indiquent où les bulles sont épinglées. Pour de meilleurs résultats, la bulle épinglera à l’extrémité capillaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Résultats des microtensiomètres de l’étude d’adsorption pour les adsorptions à pression constante (orange) et à surface constante (bleu). La surface de la bulle pour l’adsorption à surface constante augmente considérablement tout au long de l’étude et fait en sorte que l’adsorption prenne plus de temps pour atteindre la même tension superficielle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Oscillation typique du contrôle de la surface. (A) Données sur la pression, (B) la courbure et (C) la surface. Les données de surface sont une sinusoïde alors que les données de pression et de courbure ne le sont pas, comme en témoignent les valeurs d’axe n’étant pas au point médian de l’oscillation. La relation mathématique entre les trois valeurs signifie qu’une seule peut être une véritable sinusoïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Échantillon des résultats rhéologiques après analyse. Module dilatationnel de Lyso PC (1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine) en fonction de la fréquence pour augmenter les concentrations de Lyso PC pour les bulles de rayon d’environ 45 μm. Les concentrations >0,1 mM de Lyso PC qui accompagnent l’inflammation diminuent le module dilatationnel sur la plage de ventilation / fréquence respiratoire normale (jaune) pour faire 2ε-γ < 0, qui est la valeur croisée pour induire l’instabilité de Laplace (ligne rouge pointillée). De faibles concentrations de Lyso PC ≤0,01 mM, qui peuvent survenir dans les poumons normaux, n’induisent pas d’instabilité. À des fréquences >10 rad/sec, toutes les concentrations de Lyso PC sont supérieures au croisement et ne seraient pas sensibles à l’instabilité de Laplace. Les lignes rouges pleines sont des ajustements théoriques aux données. Figure reproduite à partir de la référence9. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Résultats du CFM et du CPM pour une étude d’échange de solvants pour le tensioactif pulmonaire échangé avec de l’eau DI puis du Lyso PC. (A) montre comment la tension superficielle et le module dilatationnel de surface changent tout au long de l’étude. Le graphique est séparé en quatre régions : lorsque le tensioactif pulmonaire est adsorbé sur l’interface (bleu), lorsque le LS est échangé avec de l’eau DI (vert), lorsque la solution d’échange est remplacée par une solution Lyso PC (rouge) et lorsque la cellule est remplie de la solution Lyso PC (orange). Les propriétés peuvent être vues changer tout au long des différents échanges indiquant que l’interface change. (B) montre une image confocale du tensioactif pulmonaire adsorbé sur l’interface avant l’échange et (C) montre la même surface après l’échange avec la solution Lyso PC. Dans les deux cas, le cercle pointillé blanc indique le bord interne du capillaire. La structure des domaines sur la monocouche change radicalement après l’échange de solvant, corroborant les résultats du CPM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1: Vidéo confocale de l’étude d’adsorption à pression constante pour le tensioactif pulmonaire. La fausse couleur montre la distance dans la direction z avec la barre de couleur sur le côté gauche de la vidéo, le violet indiquant la bulle près du capillaire et le vert étant le haut de la bulle. L’interface est initialement faiblement éclairée car seule une petite partie du tensioactif fluorescent est adsorbée. Au fur et à mesure que de plus en plus de tensioactifs s’adsorbent, la bulle commence à se développer à mesure que la couleur passe au vert et que l’interface devient peuplée de domaines LC noirs qui peuvent se déplacer à travers l’interface. Les agrégats de tensioactif dans la solution peuvent être vus flottant dans la solution sous forme de formes amorphes brillantes et plusieurs se déposent sur l’interface de bulle, se désintégrant et déposant leur tensioactif sur l’interface. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2: Vidéo confocale de l’étude d’oscillation pour le tensioactif pulmonaire. La fausse couleur indique la distance dans la direction z avec la barre de couleur sur le côté gauche de la vidéo. La surface est soumise à plusieurs fréquences d’oscillation différentes et les domaines LC sombres sur l’interface peuvent être vus changer tout au long des oscillations. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Figure supplémentaire 1 : Exemple d’une étape intermédiaire dans le code pour déterminer la rhéologie dilatationnelle. Lorsque cet écran s’affiche, l’utilisateur doit cliquer avec le bouton gauche sur le bord le plus à gauche de l’oscillation à analyser, puis cliquer avec le bouton gauche sur le bord le plus à droite. Plusieurs oscillations peuvent être analysées afin que l’utilisateur puisse cliquer avec le bouton gauche de la souris sur 1, 2, 3 et 4, puis cliquer avec le bouton droit de la souris pour analyser ces deux oscillations. Les oscillations montrées sont d’amplitudes et de fréquences différentes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Exemple des résultats graphiques produits par le code de rhéologie dilatationnelle. Cela montre les ajustements des sinusoïdes aux oscillations de pression, de rayon, de surface et de tension superficielle ainsi que la transformée de Fourier de chaque oscillation. Idéalement, la deuxième harmonique de la transformée de Fourier devrait être inférieure à 10% de la première harmonique pour la surface et la tension superficielle. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Modes de fonctionnement alternatifs. (A) Onde sinusoïdale, (B) Onde en dents de scie, (C) Onde carrée, (D) Onde triangulaire, (E) Expansion à vitesse constante et (F) Compression à vitesse constante. Les modes de compression et d’expansion permettent de créer des isothermes de type Langmuir pour les tensioactifs insolubles. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 1: Microtensiomètre Interface.vi virtuel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier de codage supplémentaire 2 : Dilatational_Rheology_Analysis Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Le CPM/CFM combiné est un outil puissant pour examiner la dynamique interfaciale, les équilibres et la morphologie. Ce protocole décrit les étapes nécessaires à l’obtention de données avec CPM/CFM.

La figure 2 montre la conception de la cellule avec les canaux pour le capillaire, le solvant et l’échange de chaleur indiqués. L’entrée pour l’échange de solvant doit être au bas de la cellule tandis que la sortie doit être en haut, ce qui permet à la cellule de ne pas déborder pendant l’échange. En pratique, les débits d’entrée et de sortie peuvent être légèrement différents pour une même pompe péristaltique. Un problème courant avec cette conception de cellule est la fuite de la cellule. Ceci est le plus souvent causé par une mauvaise connexion entre la cellule et l’une des connexions, mais si toutes les connexions sont sèches et ne fuient pas, cela peut être dû à une fissure dans la glissière de verre de la cellule due à un serrage excessif des boulons entourant la cellule.

La figure 3 montre les connexions entre les différentes pompes et la cellule ainsi que l’alignement de la cellule avec les objectifs CFM et CPM. La caméra CPM (4) est utilisée pour imager la forme de la bulle pendant le fonctionnement. La caméra CPM doit être équipée d’un filtre optique qui empêche la lumière laser excitante CFM d’entrer dans la caméra CPM. Sinon, le laser CFM rend les images de la caméra CPM extrêmement bruyantes et difficiles à adapter à l’aide de l’analyse d’images. Une soupape de sécurité relie la pompe capillaire et la pompe microfluidique (7) et permet d’apporter des modifications à la pompe et à la source de pression d’air, sans risque de refoulement de la cellule atteignant la pompe. Une deuxième valve (13) donne accès à une seringue pour permettre l’injection directe de liquide dans et hors du réservoir. Il peut être nécessaire d’ajouter du liquide au réservoir en cas de fuite et peut devoir être retiré pour l’étape 8 du protocole (adsorption insoluble des tensioactifs) ou pour éliminer les bulles purgées du capillaire si elles se sont attachées à l’objectif confocal.

Au cours de chaque expérience, plusieurs étapes clés doivent être effectuées avec soin. La plupart des problèmes qui surviennent une fois que l’instrument fonctionne impliquent le capillaire lui-même. En tant que tel, une coupe et un revêtement minutieux peuvent minimiser les difficultés. Couper le capillaire au diamètre souhaité est un processus difficile et à faible rendement. Toute puce ou irrégularité dans l’extrémité du capillaire entraînera de mauvaises lectures du rayon de la bulle. De plus, si le revêtement hydrophobe n’est pas appliqué correctement, ou s’il se dégrade avec le temps et l’utilisation, la bulle ne se fixera pas correctement à l’extrémité du capillaire. Cela peut être indiqué par la bulle semblant être épinglée à l’intérieur du capillaire ou glissant le long de l’intérieur du capillaire lors d’une étude oscillatoire. Un capillaire qui est bien coupé mais qui ne s’épingle pas correctement peut être nettoyé et traité de manière hydrophobe.

Une autre étape clé et source possible d’erreur est le nettoyage du réservoir cellulaire, des tubes et des capillaires entre différents matériaux ou différentes concentrations du même matériau. Il y a beaucoup de petites crevasses dans le réservoir et le tensioactif peut adsorber et modifier les mesures prises plus tard s’il n’est pas nettoyé correctement. Un démontage complet et un trempage de la cellule sont souvent nécessaires pour assurer l’élimination de tout excès de matériau tensioactif. Il est préférable de commencer par utiliser la concentration la plus faible si une série de concentrations du même tensioactif doit être étudiée.

Parfois, il peut être difficile d’aligner le tube capillaire avec l’objectif confocal. La caméra microtensiomètre peut être utilisée pour aider à aligner l’objectif confocal, mais pour une grande distance de travail de l’objectif CFM, cela peut ne pas être utile. Si le microscope confocal est focalisé au-delà de la pointe du capillaire, la section transversale capillaire, une région dépourvue de tout matériau fluorescent, peut également être utilisée pour aider à orienter l’objectif. Si la bulle capillaire ne s’éjecte pas, il peut y avoir un problème avec la pression fournie au capillaire (qui est censé être de 150 mbar en fonctionnement normal). Cela peut être vérifié en entrant en mode de contrôle de la pression et en réglant la pression sur une valeur élevée. Si la pression n’atteint pas la pression de consigne, il y a probablement une fuite dans le tube de la pompe microfluidique ou la pompe ne reçoit pas une pression de gaz suffisante. Comme pour de nombreuses études impliquant la science des surfaces, il est important de s’assurer qu’aucun matériau contaminant n’est introduit dans les solutions à aucun moment. Si les lectures ne sont pas comme prévu (tension superficielle commençant trop bas ou diminuant trop rapidement), la fabrication d’un nouvel échantillon ou l’utilisation d’un échantillon bien étudié ou d’un liquide pur est également une bonne première étape dans le dépannage.

Plusieurs modifications peuvent être apportées à l’appareil pour atteindre d’autres objectifs expérimentaux. De l’huile ou de l’eau peuvent être ajoutées dans le capillaire permettant l’étude des interfaces huile-eau au lieu des interfaces air-eau39. Cela augmente le risque de refoulement dans la pompe, de sorte que des précautions supplémentaires doivent être prises, potentiellement même l’ajout d’un piège à huile au tuyau entre la pompe et le capillaire peut être nécessaire.

Il y a plusieurs limites au CPM/CFM. Le CPM a une plage de travail limitée de taille capillaire, 20-300 μm pour l’OD capillaire pour la pompe et l’optique dans le système. Bien qu’il soit possible d’ajouter un tensioactif insoluble à l’interface en utilisant l’échange de solvant41 ou la méthode décrite ici, la concentration de surface ne peut être déduite qu’en faisant des isothermes de tension superficielle par rapport à celles obtenues à partir d’un bac de Langmuir. CFM ne peut détecter que les matériaux fluorescents, de sorte que les matériaux non fluorescents ou non marqués par fluorescence ne peuvent pas être visualisés. De nombreux tensioactifs sont de petites molécules, et leur marquage peut potentiellement modifier leurs propriétés, bien que cela devrait être moins un problème pour les molécules tensio-actives plus grandes telles que les protéines ou les polymères26,27.

Cette méthode présente plusieurs avantages clés par rapport aux analyses CPM et CFM précédentes d’interfaces chargées de tensioactifs. Le plus important est que l’instrument hybride permet de visualiser l’interface pendant que diverses propriétés de surface dynamiques et d’équilibre sont mesurées. Les changements dans la morphologie de l’interface peuvent être directement liés à la dynamique interfaciale et aux propriétés rhéologiques. Le CFM précédent d’interfaces chargées de tensioactifs a été réalisé à l’aide d’un creux de Langmuir plat de 16,20,28,29,42,43,44,45,46,47, tandis que la méthode décrite ici peut être effectuée sur des interfaces très incurvées22 . De plus, l’ensemble de l’interface peut être imagé en une seule fois, montrant un changement traçable en temps réel de domaines spécifiques, tandis que les écoulements de surface sur l’auge de Langmuir ont conduit à des domaines entrant et sortant de la fenêtre visuelle confocale. Les compressions de surface sur cet appareil sont également isotropes, tandis que les barrières sur les creux de Langmuir ont des directions de compression particulières. Le CPM permet des oscillations de surface beaucoup plus rapides que ce qui serait possible sur un creux de Langmuir.

Le nouveau contrôle de la courbure et de la surface dans cette étude présente des avantages majeurs par rapport aux versions précédentes du CPM30. En règle générale, la taille de la bulle était contrôlée en réglant une pression capillaire fixe; pour les mesures des modules dilatationnels, la pression capillaire était oscillée. Lorsque la pression capillaire est maintenue constante, lorsque le tensioactif s’adsorbe à l’interface, la tension superficielle de la bulle diminue. Pour satisfaire l’équation de Laplace, ΔP = 2γ/R, le rayon de courbure doit diminuer à mesure que la tension superficielle diminue. Pour la bulle hémisphérique dans le CPM, la diminution du rayon de courbure de la bulle augmente la surface de la bulle 9,48:

Equation 10

dans lequel Rcest le rayon capillaire et R est le rayon de courbure de la bulle. Le rayon changeant de la bulle modifie la surface de l’interface pendant l’adsorption, ce qui complique l’analyse de l’adsorption à l’aide des équations de Ward-Tordai10,38 De plus, si la tension superficielle de la bulle est suffisamment abaissée, le rayon de la bulle deviendra plus petit que le rayon capillaire et la bulle sera éjectée. La boucle de rétroaction dans ce nouveau CPM / CFM maintient la zone de bulle constante tout au long de l’adsorption, ce qui signifie que l’équation originale de Ward-Tordai peut être utilisée, qu’il n’y a aucun risque d’éjection de bulle et que l’adsorption se produit plus rapidement car la surface n’augmente pas dans la zone. Pour les études oscillatoires, la production d’une onde sinusoïdale dans la pression ne produit pas d’onde sinusoïdale dans la surface48. Les méthodes CPM précédentes reposaient sur le maintien de faibles oscillations afin que le changement de zone causé par l’oscillation entraînée par la pression se rapproche d’une onde sinusoïdale48. La méthode décrite contrôle directement la zone de la bulle et peut être utilisée pour créer de véritables oscillations d’onde sinusoïdale dans la zone interfaciale. Il est possible de relier directement la contrainte (changement de tension superficielle) à la déformation interfaciale (changement de surface) pour calculer le module dilatationnel.

Pour faciliter la mise en œuvre de ce protocole, une brève description du code contrôlant le microtensiomètre est décrite ici. Le code se compose de trois segments dans une boucle: un émettant des commandes à la pompe microfluidique, un contrôlant le mécanisme de réinitialisation de la bulle, et un mesurant le rayon de la bulle et enregistrant les valeurs calculées. Le contrôleur de pompe dispose de trois modes de fonctionnement principaux: contrôle de la pression, contrôle de la courbure et contrôle de la zone. Dans le contrôle de la pression, l’utilisateur saisit directement un point de consigne pour la pression créée par la pompe. Ce mode est important car il ne nécessite pas de boucle de rétroaction et, en tant que tel, est le plus stable des modes. Le contrôle de courbure utilise la pression de surface mesurée précédemment et l’équation de Laplace pour calculer la pression nécessaire pour créer une interface d’une courbure donnée. Le mode de contrôle de la surface s’appuie sur cela en calculant la courbure nécessaire pour créer une surface donnée en fonction de la géométrie du capuchon sphérique, ce qui nécessite également une mesure précise du rayon capillaire. Ces deux modes sont particulièrement utiles pour les études d’adsorption et d’oscillation, mais nécessitent un flux constant de données de pression de surface cohérentes. En tant que tel, l’alimentation de ces deux contrôleurs peut avoir besoin d’être lissée à partir des données brutes pour un meilleur fonctionnement. Lorsque la solution n’est pas assez claire, souvent en raison d’un échantillon très trouble, ce mode ne fonctionnera pas correctement car il n’est pas possible d’obtenir une bonne image de l’interface à bulles. Les commandes de l’oscillation sont également incluses dans cette section du code. Le segment central du code permet de dégager la bulle du capillaire. Ici, la pression de réglage du capillaire est réglée sur une valeur élevée et maintenue là pendant un certain temps, ce qui permet à la bulle de sauter et à la création d’une nouvelle interface. La dernière section du code utilise un logiciel d’acquisition de vision pour suivre le bord de la bulle et mesurer son rayon. Ce rayon est ensuite utilisé avec l’équation de Laplace pour calculer la tension superficielle, qui est ensuite introduite dans la partie initiale de la boucle.

Cette technique hybride CPM/CFM s’est avérée très bénéfique pour nos études sur les tensioactifs pulmonaires modèles et cliniques aux interfaces air-eau. Les dimensions des bulles se rapprochent de celles des alvéoles dans le poumon humain et les effets de la courbure interfaciale sur la morphologie et la dynamique des monocouches de tensioactifs pulmonaires peuvent être observés 9,10,22. L’instrument hybride sera également important pour les études d’autres matériaux tensioactifs qui sont omniprésents dans des applications allant de la pétrochimie aux produits chimiques ménagers, des films lacrymaux à la stabilisation des anticorps. Le CPM/CFM combiné nous permet de sonder les propriétés interfaciales dynamiques à l’échelle des domaines séparés par phase et de visualiser les morphologies à la surface à mesure que les conditions externes changent. Cette méthode est particulièrement utile dans les applications où des matériaux coûteux nécessitent l’utilisation d’échantillons de taille minimale. L’observation simultanée de la dynamique interfaciale et de la morphologie monocouche est presque impossible avec toute autre technique, ce qui la rend largement applicable au domaine de la science interfaciale.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Toutes les images de microscopie confocale ont été obtenues à l’aide du microscope confocal vertical Nikon A1RHD Multiphoton. Nous reconnaissons les conseils et l’assistance du personnel de soutien, en particulier Guillermo Marques, du Centre d’imagerie universitaire de l’Université du Minnesota. Ce travail a été soutenu par la subvention NIH HL51177. SI a été soutenu par une subvention de formation à la recherche institutionnelle de Ruth L. Kirschstein NRSA F32 HL151128.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 O.D. Tygon tubing Fischer Scientific Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope Nikon Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix Alconox 2510 Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter Sutter Instruments
Chloroform Sigma-Aldrich 650471 HPLC Plus
Curosurf Chiesi  Lung Surfactant
Di Water 18.5 MΩ - cm
Ethanol any 200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator Dolan-Jenner Industries Inc. 281900100 Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module Fluigent LU-FEZ-0069 Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs Fluigent Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter Norgren F07-100-A3TG Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator Norgren 10R0400R Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary Sutter Instruments B150-86-10 Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide any 75 mm x 25 mm
Glass Syringe Hamilton 84878 25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent Sigma-Aldrich 667420 1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant Avanti 850355C-200mg 16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software National Instruments 2017
Longpass Filter ThorLabs FEL0650 650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC Avanti 855675P 16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head Masterflex HV-77916-20 Peristaltic Pump
MATLAB Mathworks R2019
Micropipette Puller P-1000 Sutter Instruments Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective Nikon Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module National Instruments Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings IDEX F-120x 10-32 Coned Ports
PEEK plug IDEX P-551 10-31 Coned Ports
pippette tips Eppendorf 22492225 100 μL - 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps Thermo Scientific 6320-0010
Plastic Syringe Fischer Scientific 14-955-459 10 mL
Plumbing parts Fischer Scientific 3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL Eppendorf 3123000063 Micro pipetter
Sulfuric Acid any Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm Nikon Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt Thermo Fischer Scientific 1395MP Fluorophore
Vaccum Pump Gast DOA-P704-AA

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Ingénierie numéro 187 microtensiomètre à pression capillaire rhéologie interfaciale tensioactif pulmonaire microscopie confocale morphologie de surface microfluidique
Microtensiomètre pour la visualisation en microscopie confocale d’interfaces dynamiques
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Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, … More

Iasella, S. V., Barman, S., Ciutara, C., Huang, B., Davidson, M. L., Zasadzinski, J. A. Microtensiometer for Confocal Microscopy Visualization of Dynamic Interfaces. J. Vis. Exp. (187), e64110, doi:10.3791/64110 (2022).

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