Microtensiometro per microscopia confocale Visualizzazione di interfacce dinamiche

Summary

Questo manoscritto descrive la progettazione e il funzionamento di un microscopio microtensiometrico / confocale per eseguire misurazioni simultanee della tensione interfacciale e della reologia dilatazionale superficiale visualizzando la morfologia interfacciale. Ciò fornisce la costruzione in tempo reale di relazioni struttura-proprietà di interfacce importanti nella tecnologia e nella fisiologia.

Abstract

L’adsorbimento di molecole tensioattive in interfacce fluido-fluido è onnipresente in natura. La caratterizzazione di queste interfacce richiede la misurazione dei tassi di adsorbimento dei tensioattivi, la valutazione delle tensioni superficiali di equilibrio in funzione della concentrazione di tensioattivi di massa e la relazione su come la tensione superficiale cambia con i cambiamenti nell’area interfacciale dopo l’equilibrio. La visualizzazione simultanea dell’interfaccia utilizzando l’imaging a fluorescenza con un microscopio confocale ad alta velocità consente la valutazione diretta delle relazioni struttura-funzione. Nel microtensiometro a pressione capillare (CPM), una bolla d’aria emisferica viene bloccata all’estremità del capillare in un serbatoio liquido di volume di 1 mL. La pressione capillare attraverso l’interfaccia della bolla è controllata tramite un regolatore di flusso microfluidico commerciale che consente il controllo della pressione, della curvatura della bolla o dell’area della bolla basato su modello basato sull’equazione di Laplace. Rispetto alle tecniche precedenti come il trogolo Langmuir e la goccia pendente, la precisione di misurazione e controllo e il tempo di risposta sono notevolmente migliorati; le variazioni di pressione capillare possono essere applicate e controllate in millisecondi. La risposta dinamica dell’interfaccia a bolle viene visualizzata tramite una seconda lente ottica mentre la bolla si espande e si contrae. Il contorno della bolla è adatto a un profilo circolare per determinare il raggio di curvatura della bolla, R, nonché eventuali deviazioni dalla circolarità che invaliderebbero i risultati. L’equazione di Laplace viene utilizzata per determinare la tensione superficiale dinamica dell’interfaccia. Dopo l’equilibrio, piccole oscillazioni di pressione possono essere imposte dalla pompa microfluidica controllata dal computer per oscillare il raggio della bolla (frequenze di 0,001-100 cicli / min) per determinare il modulo dilatazionale Le dimensioni complessive del sistema sono sufficientemente piccole che il microtensiometro si adatta sotto la lente di un microscopio confocale ad alta velocità consentendo di tracciare quantitativamente le specie chimiche marcate con fluorescenza con risoluzione laterale submicronica.

Introduction

Le interfacce aria-acqua coperte da pellicole tensioattive sono onnipresenti nella vita quotidiana. Le iniezioni di tensioattivi-acqua vengono utilizzate per migliorare il recupero del petrolio dai campi esauriti e vengono utilizzate come soluzioni di fratturazione idraulica per gas e petrolio di scisto. Le schiume gas-liquido e le emulsioni liquido-liquide sono comuni a molti processi industriali e scientifici come lubrificanti e detergenti e sono comuni negli alimenti. Tensioattivi e proteine alle interfacce stabilizzano le conformazioni anticorpali durante il confezionamento, lo stoccaggio e la somministrazione 1,2,3,4,5, la stabilità del film lacrimale nell’occhio ^6,7,8 e la meccanica polmonare 9,10,11,12,13,14, ¹⁵.

Lo studio dei tensioattivi o tensioattivi adsorbenti alle interfacce e delle loro proprietà ha una lunga storia con molte tecniche sperimentali diverse 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27 . Uno sviluppo recente è il microtensiometro a pressione capillare (CPM), che consente l’esame delle proprietà interfacciali su interfacce altamente curve, a scale di lunghezza molto più piccole, utilizzando significativamente meno materiali rispetto ad altri metodi comuni 9,23,24,25. La microscopia a fluorescenza confocale (CFM) può essere utilizzata per studiare la morfologia dei lipidi e delle proteine alle interfacce aria-acqua nel CPM²² o sulle depressioni di Langmuir 20,26,27,28,29. Qui un CPM e cfM sono stati combinati per collegare i fenomeni morfologici alle proprietà interfacciali dinamiche e di equilibrio per sviluppare relazioni struttura-funzione per interfacce biologiche e tecnologiche.

Esistono numerosi parametri importanti nei sistemi di tensioattivi interfacciali accessibili al CPM-CFM. Nel CPM, una bolla d’aria di 30-200 μm di diametro è bloccata sulla punta di un tubo capillare di vetro. Nelle versioni precedenti del CPM, la differenza di pressione capillare tra l’interno e l’esterno della bolla era controllata tramite una colonna d’acqua e una pompa oscillatoria a siringa ^9,30 ; la nuova versione qui descritta li sostituisce con una pompa microfluidica controllata da computer a maggiore precisione. La tensione superficiale (γ) è determinata tramite l’equazione di Laplace, ΔP = 2γ/R, dalla caduta di pressione attraverso l’interfaccia impostata dalla pompa, ΔP, e l’analisi ottica del raggio di curvatura della bolla, R. La tensione superficiale dinamica dell’interfaccia può essere determinata con una risoluzione temporale di 10 ms a seguito della generazione di una nuova bolla a contatto con un liquido sfuso contenente un tensioattivo solubile. La dinamica di adsorbimento dei tensioattivi può essere descritta dalla classica equazione^di Ward-Tordai ^10,31 per determinare le proprietà essenziali del tensioattivo, tra cui la diffusività, la copertura superficiale e la relazione tra concentrazione di massa e tensione superficiale di equilibrio. Una volta raggiunta una tensione superficiale di equilibrio, l’area interfacciale può essere oscillata per misurare il modulo dilatazionale, , registrando le variazioni della tensione superficiale, indotte da piccoli cambiamenti nella superficie della bolla, A³². Per interfacce più complesse che sviluppano proprie strutture interne come polimeri o proteine entangled, la tensione superficiale, , è sostituita da una più generale sollecitazione superficiale ^4,33, .

La stabilità polmonare durante la respirazione può essere direttamente legata al mantenimento sia di una bassa tensione superficiale che di un elevato modulo dilatazionale all’interfaccia aria-liquido alveolare ^9,10. Tutte le superfici polmonari interne sono rivestite con un film continuo di fluido epiteliale di rivestimento denso di micron per mantenere l’idratazione dei tessuti³⁴. Questo fluido di rivestimento epiteliale è principalmente acqua, con sali e varie altre proteine, enzimi, zuccheri e tensioattivi polmonari. Come nel caso di qualsiasi interfaccia liquido-vapore curva, viene indotta una pressione capillare con la pressione più alta all’interno dell’alveolo (o bolla). Tuttavia, se la tensione superficiale fosse costante ovunque all’interno dei polmoni, l’equazione di Laplace, ΔP = 2γ/R, mostra che gli alveoli più piccoli avrebbero una pressione interna più elevata rispetto agli alveoli più grandi, costringendo il contenuto di gas degli alveoli più piccoli a fluire verso alveoli più grandi e a bassa pressione. Questo è noto come “Instabilità di Laplace”^9,35. Il risultato netto è che gli alveoli più piccoli collasserebbero e si riempirebbero di liquido e diventerebbero difficili da rigonfiare causando il collasso di parte del polmone, e altre parti si gonfierebbero eccessivamente, entrambi sintomi tipici della sindrome da distress respiratorio acuto (ARDS). Tuttavia, in un polmone correttamente funzionante, la tensione superficiale cambia dinamicamente quando l’interfaccia aria-liquido epiteliale nell’area interfacciale dell’alveolo si espande e si contrae durante la respirazione. Se , o , la pressione di Laplace diminuisce con raggio decrescente e aumenta con l’aumentare del raggio in modo da eliminare l’instabilità di Laplace, stabilizzando così il polmone⁹. Quindi, e come dipende dalla frequenza, dalla morfologia e dalla composizione del monostrato e dalla composizione del fluido alveolare può essere essenziale per la stabilità polmonare. Il CPM-CFM ha inoltre fornito le prime dimostrazioni degli effetti della curvatura interfacciale sull’adsorbimento dei tensioattivi²⁵, sulla morfologia monostrato²² e sul modulo dilatazionale⁹. Il piccolo volume (~ 1 mL) del serbatoio nel CPM consente la rapida introduzione, rimozione o scambio della fase liquida e riduce al minimo la quantità richiesta di costose proteine o tensioattivi¹⁰.

Il contrasto in un’immagine CPM-CFM è dovuto alla distribuzione di piccole frazioni di lipidi o proteine marcati fluorescentemente all’interfaccia^16,27. I monostrati bidimensionali di tensioattivi spesso presentano una separazione di fase laterale in funzione della tensione superficiale o della pressione superficiale, π è la differenza tra la tensione superficiale di un’interfaccia fluido-fluido pulita, γ₀, e un’interfaccia ricoperta di tensioattivo, γ. π può essere pensato come la “pressione” 2D causata dalle interazioni delle molecole di tensioattivo all’interfaccia che agisce per abbassare la tensione superficiale del fluido puro. A basse pressioni superficiali, i monostrati lipidici sono in uno stato disorganizzato simile a un liquido; questa è nota come fase espansa liquida (LE). Man mano che la pressione superficiale aumenta e l’area per molecola lipidica diminuisce, i lipidi si orientano tra loro e possono subire una transizione di fase di primo ordine alla fase^condensata liquida ordinata (LC) a lungo raggio ^16,20,27. Le fasi LE e LC possono coesistere a varie pressioni superficiali e possono essere visualizzate come lipidi marcati fluorescentemente sono esclusi dalla fase LC e si segregano nella fase LE. Pertanto, la fase LE è luminosa e la fase LC è scura quando viene visualizzata con CFM¹⁶.

L’obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere i passaggi necessari per costruire e far funzionare il microscopio confocale combinato microtensiometro. Ciò consentirà al lettore di eseguire studi di adsorbimento, misurare la tensione superficiale, il comportamento reologico ed esaminare simultaneamente la morfologia interfacciale su scala micron aria/acqua o olio/acqua. Ciò include una discussione su come tirare, tagliare e idrofobizzare i capillari richiesti, istruzioni per l’utilizzo delle modalità di controllo della pressione, della curvatura e della superficie e trasferimento interfacciale del tensioattivo insolubile all’interfaccia curva del microtensiometro.

Protocol

1. Preparazione dei tubi capillari Posizionare il capillare in un estrattore capillare ed eseguire il programma di trazione desiderato per creare due capillari affusolati con un diametro esterno (OD) di ~ 1 μm sulla punta.NOTA: L’OD del capillare prima di tirare deve essere l’OD specificato per adattarsi al supporto capillare nella cella del microtensiometro. Il diametro interno (ID) del capillare può variare, ma influenzerà il raggio critico del capillare dopo la trazione. Viene scelto …

Representative Results

Una delle principali fonti di errore di misurazione deriva dai capillari che presentano difetti sia dal processo di taglio (Figura 5A,B) che dal processo di rivestimento (Figura 5D). Entrambi i tipi di difetti portano a errori nel determinare la forma e la dimensione della bolla da parte del sistema di analisi ottica delle immagini, portando a valori di tensione superficiale imprecisi. È importante esaminare attentamente ogni nuovo capillare do…

Discussion

Il CPM /CFM combinato è un potente strumento per esaminare le dinamiche interfacciali, gli equilibri e la morfologia. Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere dati con CPM/CFM.

La Figura 2 mostra il design della cella con i canali per lo scambio capillare, solvente e termico indicati. L’ingresso per lo scambio di solventi dovrebbe essere nella parte inferiore della cella mentre l’uscita dovrebbe essere nella parte superiore, consentendo alla c…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA