Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas

Summary

Este manuscrito describe el diseño y operación de un microscopio microtensómetro/confocal para realizar mediciones simultáneas de tensión interfacial y reología dilatacional superficial mientras visualiza la morfología interfacial. Esto proporciona la construcción en tiempo real de relaciones estructura-propiedad de interfaces importantes en tecnología y fisiología.

Abstract

La adsorción de moléculas tensoactivas a interfaces fluido-fluido es omnipresente en la naturaleza. La caracterización de estas interfaces requiere medir las tasas de adsorción de surfactante, evaluar las tensiones superficiales de equilibrio en función de la concentración de surfactante a granel y relacionar cómo cambia la tensión superficial con los cambios en el área interfacial después del equilibrio. La visualización simultánea de la interfaz mediante imágenes de fluorescencia con un microscopio confocal de alta velocidad permite la evaluación directa de las relaciones estructura-función. En el microtensiómetro de presión capilar (CPM), una burbuja de aire hemisférica se fija al final del capilar en un depósito líquido de 1 ml de volumen. La presión capilar a través de la interfaz de burbujas se controla a través de un controlador de flujo microfluídico comercial que permite el control de presión, curvatura de burbujas o área de burbujas basado en modelos basado en la ecuación de Laplace. En comparación con técnicas anteriores como el canal de Langmuir y la caída colgante, la precisión de medición y control y el tiempo de respuesta se mejoran considerablemente; Las variaciones de presión capilar se pueden aplicar y controlar en milisegundos. La respuesta dinámica de la interfaz de la burbuja se visualiza a través de una segunda lente óptica a medida que la burbuja se expande y se contrae. El contorno de burbuja se ajusta a un perfil circular para determinar el radio de curvatura de la burbuja, R, así como cualquier desviación de la circularidad que invalide los resultados. La ecuación de Laplace se utiliza para determinar la tensión superficial dinámica de la interfaz. Después del equilibrio, la bomba microfluídica controlada por computadora puede imponer pequeñas oscilaciones de presión para oscilar el radio de burbuja (frecuencias de 0.001-100 ciclos / min) para determinar el módulo dilatacional Las dimensiones generales del sistema son lo suficientemente pequeñas como para que el microtensómetro quepa bajo la lente de un microscopio confocal de alta velocidad que permite rastrear cuantitativamente las especies químicas marcadas fluorescentemente con resolución lateral submicrona.

Introduction

Las interfaces aire-agua cubiertas por películas de surfactante son omnipresentes en la vida diaria. Las inyecciones de agua de surfactante se utilizan para mejorar la recuperación de petróleo de campos agotados y se utilizan como soluciones de fracturación hidráulica para gas y petróleo de esquisto. Las espumas gas-líquido y las emulsiones líquido-líquido son comunes a muchos procesos industriales y científicos como lubricantes y agentes de limpieza y son comunes en los alimentos. Los surfactantes y las proteínas en las interfaces estabilizan las conformaciones de anticuerpos durante el envasado, almacenamiento y administración ^1,2,3,4,5, la estabilidad de la película lagrimal en el ojo ^6,7,8 y la mecánica pulmonar ^{9,10,11,12,13,14}, ¹⁵.

El estudio de los agentes tensioactivos o tensioactivos que se adsorben a las interfaces y sus propiedades tiene una larga historia con muchas técnicas experimentales diferentes ^{16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27} . Un desarrollo reciente es el microtensómetro de presión capilar (CPM), que permite el examen de las propiedades interfaciales en interfaces altamente curvas, a escalas de longitud mucho más pequeñas, mientras que utiliza significativamente menos materiales que otros métodos comunes 9,23,24,25. La microscopía de fluorescencia confocal (CFM) se puede utilizar para estudiar la morfología de lípidos y proteínas en las interfaces aire-agua en la CPM²² o en los canales de Langmuir 20,26,27,28,29. Aquí se han combinado un CPM y un CFM para conectar fenómenos morfológicos con propiedades interfaciales dinámicas y de equilibrio para desarrollar relaciones estructura-función para interfaces biológicas y tecnológicas.

Existen numerosos parámetros de importancia en los sistemas de surfactantes interfaciales accesibles al CPM-CFM. En el CPM, una burbuja de aire de 30-200 μm de diámetro se fija a la punta de un tubo capilar de vidrio. En versiones anteriores del CPM, la diferencia de presión capilar entre el interior y el exterior de la burbuja se controlaba a través de una columna de agua y una bomba de jeringa oscilatoria ^9,30 ; la nueva versión descrita aquí los reemplaza con una bomba microfluídica controlada por computadora de mayor precisión. La tensión superficial (γ) se determina a través de la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ/R, a partir de la caída de presión a través de la interfaz establecida por la bomba, ΔP, y el análisis óptico del radio de curvatura de la burbuja, R. La tensión superficial dinámica de la interfaz se puede determinar con una resolución de tiempo de 10 ms después de la generación de una nueva burbuja en contacto con un líquido a granel que contiene un surfactante soluble. La dinámica de adsorción del surfactante se puede describir mediante la ecuación clásica de Ward-Tordai^10,31 para determinar las propiedades esenciales del surfactante, incluida la difusividad, la cobertura superficial y la relación entre la concentración a granel y la tensión superficial de equilibrio. Una vez que se alcanza una tensión superficial de equilibrio, el área interfacial se puede oscilar para medir el módulo dilatacional, registrando los cambios en la tensión superficial, inducidos por pequeños cambios en el área de superficie de la burbuja, A³². Para interfaces más complejas que desarrollan sus propias estructuras internas como polímeros o proteínas entrelazadas, la tensión superficial, , se sustituye por una tensión superficial más general ^4,33, .

La estabilidad pulmonar durante la respiración puede estar directamente relacionada con el mantenimiento de una tensión superficial baja y un módulo dilatacional alto en la interfaz aire-líquido alveolar ^9,10. Todas las superficies pulmonares internas están revestidas con una película continua de micras de espesor de líquido de revestimiento epitelial para mantener la hidratación del tejido³⁴. Este líquido de revestimiento epitelial es principalmente agua, con sales y varias otras proteínas, enzimas, azúcares y surfactante pulmonar. Como es el caso de cualquier interfaz curva líquido-vapor, se induce una presión capilar con la presión más alta en el interior del alvéolo (o burbuja). Sin embargo, si la tensión superficial fuera constante en todas partes dentro de los pulmones, la ecuación de Laplace, ΔP = 2γ / R, muestra que los alvéolos más pequeños tendrían una presión interna más alta en relación con los alvéolos más grandes, lo que obligaría a los contenidos de gas de los alvéolos más pequeños a fluir a alvéolos más grandes y de menor presión. Esto se conoce como “Inestabilidad de Laplace”^9,35. El resultado neto es que los alvéolos más pequeños colapsarían y se llenarían de líquido y se volverían difíciles de volver a inflar, lo que haría que parte del pulmón colapsara, y otras partes se inflarían en exceso, los cuales son síntomas típicos del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA). Sin embargo, en un pulmón que funciona correctamente, la tensión superficial cambia dinámicamente a medida que la interfaz aire-líquido epitelial en el área interfacial del alvéolo se expande y se contrae durante la respiración. Si , o , la presión de Laplace disminuye con el radio decreciente y aumenta con el aumento del radio para eliminar la inestabilidad de Laplace, estabilizando así el pulmón⁹. Por lo tanto, y cómo depende de la frecuencia, la morfología y composición monocapa, y la composición del líquido alveolar pueden ser esenciales para la estabilidad pulmonar. El CPM-CFM también ha proporcionado las primeras demostraciones de los efectos de la curvatura interfacial sobre la adsorción de surfactante²⁵, la morfología monocapa²² y el módulo dilatacional⁹. El pequeño volumen (~1 ml) del reservorio en el CPM permite la rápida introducción, eliminación o intercambio de la fase líquida y minimiza la cantidad requerida de proteínas o surfactantes costosos¹⁰.

El contraste en una imagen CPM-CFM se debe a la distribución de pequeñas fracciones de lípidos o proteínas marcados fluorescentemente en la interfaz^16,27. Las monocapas de surfactante bidimensional a menudo exhiben separación de fase lateral en función de la tensión superficial o la presión superficial, π es la diferencia entre la tensión superficial de una interfaz fluido-fluido limpia, γ₀, y una interfaz cubierta de surfactante, γ. π puede pensarse como la “presión” 2-D causada por las interacciones de las moléculas de surfactante en la interfaz que actúa para reducir la tensión superficial del fluido puro. A bajas presiones superficiales, las monocapas lipídicas están en un estado desorganizado similar al líquido; esto se conoce como la fase de expansión líquida (LE). A medida que aumenta la presión superficial y disminuye el área por molécula lipídica, los lípidos se orientan entre sí y pueden sufrir una transición de fase de primer orden a la fase condensada líquida ordenada (LC) de largo alcance 16,20,27. Las fases LE y LC pueden coexistir a varias presiones superficiales y se pueden visualizar a medida que los lípidos marcados fluorescentemente se excluyen de la fase LC y se segregan a la fase LE. Por lo tanto, la fase LE es brillante y la fase LC es oscura cuando se visualiza con CFM¹⁶.

El objetivo de este manuscrito es describir los pasos necesarios para construir y operar el microtensómetro combinado de microscopio confocal. Esto permitirá al lector realizar estudios de adsorción, medir la tensión superficial, el comportamiento reológico y examinar la morfología interfacial simultáneamente en una interfaz aire/agua o aceite/agua a escala micrométrica. Esto incluye una discusión sobre cómo tirar, cortar e hidrofobizar los capilares requeridos, instrucciones para usar los modos de control de presión, curvatura y área de superficie, y transferencia interfacial de surfactante insoluble a la interfaz curva del microtensiómetro.

Protocol

1. Preparación de tubos capilares Coloque el capilar en un extractor capilar y ejecute el programa de tracción deseado para hacer dos capilares cónicos con un diámetro exterior (OD) de ~ 1 μm en la punta.NOTA: El OD del capilar antes de tirar debe ser el OD especificado para caber en el soporte capilar en la celda del microtensómetro. El diámetro interno (ID) del capilar puede variar, pero afectará el radio crítico del capilar después de tirar. Se elige un programa de tracción pa…

Representative Results

Una fuente importante de error de medición surge de los capilares que tienen defectos, ya sea del proceso de corte (Figura 5A, B) o del proceso de recubrimiento (Figura 5D). Ambos tipos de defectos conducen a errores en la determinación de la forma y el tamaño de la burbuja por el sistema de análisis óptico de imágenes, lo que lleva a valores de tensión superficial inexactos. Es importante examinar cuidadosamente cada nuevo capilar despu?…

Discussion

El CPM/CFM combinado es una herramienta poderosa para examinar la dinámica interfacial, los equilibrios y la morfología. Este protocolo describe los pasos necesarios para obtener datos con CPM/CFM.

La Figura 2 muestra el diseño de la célula con canales para el intercambio capilar, solvente y de calor indicado. La entrada para el intercambio de disolventes debe estar en la parte inferior de la celda, mientras que la salida debe estar en la parte superior, lo qu…

Materials

1.5 O.D. Tygon tubing	Fischer Scientific		Tubing
A1RHD Multiphoton upright confocal microscope	Nikon		Confocal Microscope
Acid Cleaning Solution			Sulfuric acid and Alnochromix diluted with water 50% by volume, wait until clear befor diluting
Alnochromix	Alconox	2510	Mixed with sulfuric acid to package instructionand diluted to make acid cleaning solution
Ceramic glass cutter	Sutter Instruments
Chloroform	Sigma-Aldrich	650471	HPLC Plus
Curosurf	Chiesi		Lung Surfactant
Di Water			18.5 MΩ – cm
Ethanol	any		200 proof used for hydrophobization, denatured used for cleaning
Fiber-Lite Model 190 fiber optic illuminator	Dolan-Jenner Industries Inc.	281900100	Light source; other light sources should work as well
Flow EZ F69 mbar w/Link Module	Fluigent	LU-FEZ-0069	Microfluidic Pump
Fluigent SDK VIs	Fluigent		Required for CPM virtual Interface
Fluoroelastomer gaskets			Machined from 1 mm thick Viton sheet, See figure 3
Gas filter	Norgren	F07-100-A3TG	Put between microfluidic pump and pressure regulator
Gas regulator	Norgren	10R0400R	Steps down pressure from sorce to range of pump, connected to gas filter range 2-120 psi
Glass Capilary	Sutter Instruments	B150-86-10	Borosilicate glass O.D. 1.5 mm I.D. 0.86 mm
Glass Slide	any		75 mm x 25 mm
Glass Syringe	Hamilton	84878	25 μL glass syringe
Hydrophobizing Agent	Sigma-Aldrich	667420	1H,1H,2H,2H-Perfluoro-octyltriethoxysilane 98%, other hydrophobic triethoxysilane can be substituted
Insoluble surfactant	Avanti	850355C-200mg	16:0 DPPC in chloroform
LabVIEW Software	National Instruments		2017
Longpass Filter	ThorLabs	FEL0650	650 nm Longpass filter, wavelength must remove excitation lazer frequence
Lyso-PC	Avanti	855675P	16:0 Lyso PC 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphocholine
Masterflex L/S variable speed analog consol pump system w/  Easy-Load II pump head	Masterflex	HV-77916-20	Peristaltic Pump
MATLAB	Mathworks		R2019
Micropipette Puller P-1000	Sutter Instruments		Capillary Puller
Microtensiometer Cell and Holder			Cell machined from PEEK, holder machined from aluminum, See Figure 3 and 4
Microtensiometer Objective	Nikon		Fluor 20x/0.50W DIC M/N2 ∞/0 WD 2.0 mm
NI Vision Development Module	National Instruments		Required for CPM virtual Interface
PEEK finger tight fittings	IDEX	F-120x	10-32 Coned Ports
PEEK plug	IDEX	P-551	10-31 Coned Ports
pippette tips	Eppendorf	22492225	100 μL – 1000 μL, Autoclaved
Plastic Forceps	Thermo Scientific	6320-0010
Plastic Syringe	Fischer Scientific	14-955-459	10 mL
Plumbing parts	Fischer Scientific		3-way valves and other plumbing parts to connect tubing.
Research Plus 1-channel 100 μL–1000 μL	Eppendorf	3123000063	Micro pipetter
Sulfuric Acid	any		Used for acid cleaning solution
T Plan SLWD 20x/0.30 OFN25 WD 30 mm	Nikon		Confocal Microscope Objective
Texas Red DHPE triethylammonim salt	Thermo Fischer Scientific	1395MP	Fluorophore
Vaccum Pump	Gast	DOA-P704-AA