التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لتهريب الخلايا: طريقة لوضع العلامات الإشعاعية للخلايا
Summary
يظهر هنا بروتوكول لخلايا التسمية الإشعاعية ذات النظائر المشعة للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، 89 Zr (t1/2 78.4 h) ، باستخدام سينثون وضع العلامات الإشعاعية الجاهزة للاستخدام ، [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89Zr] Zr-DBN). تسمح خلايا الملصقات الإشعاعية التي تحتوي على [89Zr] Zr-DBN بالتتبع والتصوير غير الباضعين للخلايا ذات العلامات الإشعاعية التي يتم إعطاؤها في الجسم باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لمدة تصل إلى 7 أيام بعد تناولها.
Abstract
تظهر علاجات الخلايا الجذعية ومستقبلات المستضدات الخيمرية (CAR) كعلاجات واعدة لتجديد الأعضاء وكعلاج مناعي لمختلف أنواع السرطان. على الرغم من التقدم الكبير الذي تم إحرازه في هذه المجالات ، لا يزال هناك المزيد الذي يجب تعلمه لفهم الحرائك الدوائية والديناميكا الدوائية للخلايا العلاجية المدارة في النظام الحي بشكل أفضل. بالنسبة للتتبع غير الجراحي للخلايا باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) ، تم تطوير طريقة جديدة [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr] Zr-DBN) بوساطة الوسم الإشعاعي للخلايا باستخدام 89Zr (t1/2 78.4 h). يصف البروتوكول الحالي [89Zr] Zr-DBN بوساطة ، جاهز للاستخدام ، موالفة إشعاعية لوضع العلامات الإشعاعية المباشرة لمجموعة متنوعة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الوسيطة ، والخلايا الجذعية الموجهة بالقلب الموجهة بالنسب ، وخلايا الكبد المتجددة للكبد ، وخلايا الدم البيضاء ، وخلايا سرطان الجلد ، والخلايا المتغصنة. تتيح المنهجية المطورة التصوير غير الجراحي بالتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لتهريب الخلايا لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الإعطاء دون التأثير على طبيعة أو وظيفة الخلايا ذات العلامات الإشعاعية. بالإضافة إلى ذلك ، يصف هذا البروتوكول طريقة تدريجية للتخليق الإشعاعي ل [89 Zr] Zr-DBN ، وصياغة متوافقة حيويا ل [89 Zr] Zr-DBN ، وإعداد الخلايا لوضع العلامات الإشعاعية ، وأخيرا وضع العلامات الإشعاعية للخلايا باستخدام [89Zr] Zr-DBN ، بما في ذلك جميع التفاصيل المعقدة اللازمة لنجاح وضع العلامات الإشعاعية للخلايا.
Introduction
تكتسب علاجات الخلايا التائية للخلايا الجذعية ومستقبلات المستضد الخيمري (CAR) شعبية وتخضع للتحقيق النشط لعلاج أمراض مختلفة ، مثل فشل عضلة القلب1،2 ، تنكس الشبكية 2 ، الضمور البقعي 2 ، مرض السكري 2 ، احتشاء عضلة القلب3،4،5 ، والسرطانات6،7،8،9 ،10. من بين النهجين المعقولين للعلاج بالخلايا الجذعية ، يمكن إما أن تكون الخلايا الجذعية مغمورة مباشرة في موقع المرض لإحداث استجابة علاجية ، أو إحداث تغييرات في البيئة المكروية لموقع المرض دون الالتزام بموقع المرض لبدء استجابة علاجية غير مباشرة. يمكن أن تسبب الاستجابة العلاجية غير المباشرة تغييرات في البيئة المكروية لموقع المرض عن طريق إطلاق العوامل التي من شأنها إصلاح المرض أو علاجه5. يمكن تقييم هذه الأساليب للعلاجات بالخلايا الجذعية عن طريق التصوير غير الباضع للخلايا الجذعية ذات العلامات الإشعاعية. يمكن أن يربط التصوير غير الباضع امتصاص الخلايا الموسومة إشعاعيا في موقع المرض باستجابة علاجية لفك رموز الاستجابة العلاجية المباشرة مقابل غير المباشرة.
بالإضافة إلى ذلك ، يتم تطوير العلاجات القائمة على الخلايا المناعية لعلاج أنواع مختلفة من السرطان باستخدام CAR T-cell6،7،8،9،10والعلاج المناعي للخلايا المتغصنة11،12. ميكانيكيا ، في العلاج المناعي للخلايا التائية CART 6،7،8،9،10 ، تم تصميم الخلايا التائية للتعبير عن حاتمة ترتبط بمستضد معين على الأورام التي تحتاج إلى علاج. ترتبط هذه الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية المهندسة ، عند تناولها ، بالمستضد المحدد الموجود على الخلايا السرطانية من خلال تفاعل مستضد الحوامة. بعد الارتباط ، تخضع الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية المرتبطة للتنشيط ثم تتكاثر وتطلق السيتوكينات ، مما يشير إلى الجهاز المناعي للمضيف لمهاجمة الورم معبرا عن المستضد المحدد. في المقابل ، في حالة علاجات الخلايا المتغصنة11,12 ، تم تصميم الخلايا المتغصنة لتقديم مستضد سرطان معين على سطحها. هذه الخلايا المتغصنة المهندسة ، عند إعطائها ، موطن الغدد الليمفاوية وترتبط بالخلايا التائية في الغدد الليمفاوية. تخضع الخلايا التائية ، عند ارتباطها بمستضدات السرطان المحددة على الخلايا المتغصنة المدارة ، للتنشيط / الانتشار وتبدأ استجابة مناعية للمضيف ضد الورم الذي يعبر عن هذا المستضد المحدد. ومن ثم ، فإن تقييم الاتجار بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الخيمرية المدارة إلى موقع الورم9,10 وتوجيه الخلايا المتغصنة إلى الغدد الليمفاوية11,12 ممكن عن طريق تصوير الخلايا التائية ذات العلامات الإشعاعية والخلايا المتغصنة لتحديد فعالية العلاج المناعي. علاوة على ذلك ، يمكن أن يساعد الاتجار بالخلايا غير الغازية في فهم الإمكانات العلاجية بشكل أفضل ، وتوضيح الاستجابة العلاجية المباشرة مقابل غير المباشرة ، والتنبؤ بالاستجابة العلاجية لكل من الخلايا الجذعية والعلاجات القائمة على الخلايا المناعية ومراقبتها.
تم استكشاف طرق تصوير مختلفة لتهريب الخلايا3،4،9،10،12 ، بما في ذلك التصوير البصري والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي المحوسب بإصدار فوتون واحد (SPECT) والتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET). كل من هذه التقنيات لها مزاياها وعيوبها. من بين هذه ، يعد التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني أكثر الطرق الواعدة نظرا لطبيعته الكمية وحساسيته العالية ، والتي تعتبر ضرورية للقياس الكمي الموثوق للخلايا في الاتجار بالخلايا القائمة على التصوير3،4،9،10.
النظير المشع الباعث للبوزيترون 89Zr ، مع عمر نصف يبلغ 78.4 ساعة ، مناسب لوضع العلامات على الخلايا. يسمح بتصوير PET لتهريب الخلايا لأكثر من أسبوع واحد ويتم إنتاجه بسهولة بواسطة السيكلوترونات الطبية منخفضة الطاقة المتوفرة على نطاق واسع13،14،15،16،17. بالإضافة إلى ذلك ، يتوفر مخلب p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) الذي يعمل بشكل مناسب تجاريا لتخليق مركب وضع العلامات على الخلايا 89Zr ، الجاهز للاستخدام ، [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ، المعروف أيضا باسم [89Zr] Zr-DBN18،19،20،21،22،23،24، 25. يعتمد مبدأ وضع العلامات الخلوية بوساطة [89 Zr] Zr-DBN على تفاعل بين الأمينات الأولية لبروتينات غشاء الخلية وجزء الأيزوثيوسيانات (NCS) ل [89Zr] Zr-DBN لإنتاج رابطة ثيوريا تساهمية مستقرة.
[89زر] تم نشر وسم الخلايا المستندة إلى Zr-DBN والتصوير لتتبع مجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة ، بما في ذلك الخلايا الجذعية 18،23،25 ، والخلايا المتغصنة18 ، والخلايا الجذعية القلبية19 ، والخلايا اللحمية النفضية 20 ، والبلاعم المشتقة من نخاع العظم 20 ، وخلايا الدم المحيطية أحادية النواة 20 ، والخلايا التائية Jurkat / CAR 21 ، وخلايا الكبد 22،24 ، وخلايا الدم البيضاء 25. يوفر البروتوكول التالي طرقا خطوة بخطوة للتحضير ووضع العلامات الإشعاعية للخلية باستخدام [89Zr] Zr-DBN ويصف التغييرات التي قد تكون مطلوبة في بروتوكول وضع العلامات الراديوية لنوع معين من الخلايا. لمزيد من الوضوح ، تنقسم طريقة وضع العلامات الإشعاعية الخلوية المعروضة هنا إلى أربعة أقسام. يتناول القسم الأول إعداد [89 Zr] Zr-DBN عن طريق مخلب 89Zr باستخدام DFO-Bn-NCS. يصف القسم الثاني إعداد تركيبة متوافقة حيويا من [89Zr] Zr-DBN يمكن استخدامها بسهولة لوضع العلامات الإشعاعية للخلية. ويغطي القسم الثالث الخطوات اللازمة للتهيئة المسبقة للخلايا من أجل وضع العلامات الإشعاعية. يتضمن التكييف المسبق للخلايا غسل الخلايا بمحلول ملحي خال من البروتين (PBS) ومحلول ملح هانكس المتوازن المخزن HEPES (H-HBSS) لإزالة البروتينات الخارجية ، والتي قد تتداخل أو تتنافس مع تفاعل [89Zr] Zr-DBN مع الأمينات الأولية الموجودة على بروتينات سطح الخلية أثناء وضع العلامات الإشعاعية. يقدم القسم الأخير الخطوات التي ينطوي عليها وضع العلامات الإشعاعية الفعلية للخلايا وتحليل مراقبة الجودة.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيما يلي خطوات حاسمة في البروتوكول تحتاج إلى تحسين من أجل وضع العلامات الإشعاعية الخلوية الفعالة. في الخطوتين 1.2 و 1.3 من البروتوكول ، اعتمادا على حجم [89 Zr] Zr (HPO 4) 2 أو [89Zr] ZrCl4 المستخدم ، يجب استخدام حجم مناسب (ميكرولتر) من القاعدة ؛ يجب استخدام محلول 1.0M K 2 CO 3 ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH 5R21HL127389-02 ، NIH 4T32HL007111-39 ، NIH R01HL134664 ، ومنح DOE DE-SC0008947 ، الوكالة الدولية للطاقة الذرية ، فيينا ، قسم Mayo Clinic للطب النووي ، قسم الأشعة ، ومركز Mayo Clinic للطب التجديدي ، روتشستر ، مينيسوتا. تم إنشاء جميع الأرقام باستخدام BioRender.com.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
References
- Bhawnani, N., et al. Effectiveness of stem cell therapies in improving clinical outcomes in patients with heart failure. Cureus. 13 (8), e17236 (2021).
- Zakrzewski, W., Dobrzynski, M., Szymonowicz, M., Rybak, Z. Stem cells: past, present, and future. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 68 (2019).
- Bukhari, A. B., Dutta, S., De, A. Image guidance in stem cell therapeutics: unfolding the blindfold. Current Drug Targets. 16 (6), 658-671 (2015).
- Momeni, A., Neelamegham, S., Parashurama, N. Current challenges for the targeted delivery and molecular imaging of stem cells in animal models. Bioengineered. 8 (4), 316-324 (2017).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circulation Research. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- D’Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Zhang, Q., et al. CAR-T cell therapy in cancer: tribulations and road ahead. Journal of Immunology Research. 2020, 1924379 (2020).
- Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: current limitations and potential strategies. Blood Cancer Journal. 11 (4), 69 (2021).
- Shao, F., et al. Radionuclide-based molecular imaging allows CAR-T cellular visualization and therapeutic monitoring. Theranostics. 11 (14), 6800-6817 (2021).
- Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
- Wang, Y., et al. Dendritic cell biology and its role in tumor immunotherapy. Journal of Hematology & Oncology. 13 (1), 107 (2020).
- Bulte, J. W. M., Shakeri-Zadeh, A. In vivo MRI tracking of tumor vaccination and antigen presentation by dendritic cells. Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 198-207 (2022).
- Holland, J. P., Sheh, Y., Lewis, J. S. Standardized methods for the production of high specific-activity zirconium-89. Nuclear Medicine and Biology. 36 (7), 729-739 (2009).
- Larenkov, A., et al. Preparation of zirconium-89 solutions for radiopharmaceutical purposes: interrelation between formulation, radiochemical purity, stability and biodistribution. Molecules. 24 (8), 1534 (2019).
- Pandey, M. K., et al. A new solid target design for the production of 89Zr and radiosynthesis of high molar activity [89Zr]Zr-DBN. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 12 (1), 15-24 (2022).
- Pandey, M. K., et al. Improved production and processing of 89Zr using a solution target. Nuclear Medicine and Biology. 43 (1), 97-100 (2016).
- Pandey, M. K., Engelbrecht, H. P., Byrne, J. P., Packard, A. B., DeGrado, T. R. Production of 89Zr via the 89Y(p,n)89Zr reaction in aqueous solution: effect of solution composition on in-target chemistry. Nuclear Medicine and Biology. 41 (4), 309-316 (2014).
- Bansal, A., et al. Novel 89Zr cell labeling approach for PET-based cell trafficking studies. EJNMMI Research. 5, 19 (2015).
- Bansal, A., et al. 89Zr]Zr-DBN labeled cardiopoietic stem cells proficient for heart failure. Nuclear Medicine and Biology. 90-91, 23-30 (2020).
- Friberger, I., et al. Optimisation of the synthesis and cell labelling conditions for [89Zr]Zr-oxine and [89Zr]Zr-DFO-NCS: a direct in vitro comparison in cell types with distinct therapeutic applications. Molecular Imaging and Biology. 23 (6), 952-962 (2021).
- Lee, S. H., et al. Feasibility of real-time in vivo 89Zr-DFO-labeled CAR T-cell trafficking using PET imaging. PLoS One. 15 (1), e0223814 (2020).
- Nicolas, C. T., et al. Hepatocyte spheroids as an alternative to single cells for transplantation after ex vivo gene therapy in mice and pig models. Surgery. 164 (3), 473-481 (2018).
- Yang, B., et al. Tracking and therapeutic value of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell transplantation in reducing venous neointimal hyperplasia associated with arteriovenous fistula. Radiology. 279 (2), 513-522 (2016).
- Nicolas, C. T., et al. Ex vivo cell therapy by ectopic hepatocyte transplantation treats the porcine tyrosinemia model of acute liver failure. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 18, 738-750 (2020).
- Bansal, A., Sharma, S., Klasen, B., Rosch, F., Pandey, M. K. Evaluation of different 89Zr-labeled synthons for direct labeling and tracking of white blood cells and stem cells in healthy athymic mice. Scientific Reports. 12 (1), 15646 (2022).
- Behfar, A., et al. Guided cardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 56 (9), 721-734 (2010).
- Charoenphun, P., et al. 89Zr]oxinate4 for long-term in vivo cell tracking by positron emission tomography. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 42 (2), 278-287 (2015).
- Sato, N., et al. In vivo tracking of adoptively transferred natural killer cells in rhesus macaques using 89zirconium-oxine cell labeling and PET imaging. Clinical Cancer Research. 26 (11), 2573-2581 (2020).
- Volpe, A., Pillarsetty, N. V. K., Lewis, J. S., Ponomarev, V. Applications of nuclear-based imaging in gene and cell therapy: probe considerations. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 447-458 (2021).
- Fogli, L. K., et al. Challenges and next steps in the advancement of immunotherapy: summary of the 2018 and 2020 National Cancer Institute workshops on cell-based immunotherapy for solid tumors. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (7), e003048 (2021).
- Li, X., Hacker, M. Molecular imaging in stem cell-based therapies of cardiac diseases. Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 71-88 (2017).
- Puges, M., et al. Retrospective study comparing WBC scan and 18F-FDG PET/CT in patients with suspected prosthetic vascular graft infection. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 57 (6), 876-884 (2019).
- Butterfield, L. H. Dendritic cells in cancer immunotherapy clinical trials: are we making progress. Frontiers in Immunology. 4, 454 (2013).
- de Vries, I. J. M., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nature Biotechnology. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Gosmann, D., et al. Promise and challenges of clinical non-invasive T-cell tracking in the era of cancer immunotherapy. EJNMMI Research. 12 (1), 5 (2022).
