Imagerie par tomographie par émission de positons du trafic cellulaire : une méthode de radiomarquage cellulaire

Summary

Nous présentons ici un protocole de radiomarquage des cellules avec un radio-isotope de tomographie par émission de positons (TEP), 89 Zr (t_1/2 78,4 h), à l’aide d’un synthétison de radiomarquage prêt à l’emploi, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). Le radiomarquage des cellules avec [⁸⁹Zr]Zr-DBN permet un suivi et une imagerie non invasifs des cellules radiomarquées administrées dans le corps par TEP jusqu’à 7 jours après l’administration.

Abstract

Les thérapies à base de cellules souches et de récepteurs antigéniques chimériques (CAR) à cellules T apparaissent comme des thérapies prometteuses pour la régénération des organes et comme immunothérapie pour divers cancers. Malgré des progrès significatifs dans ces domaines, il reste encore beaucoup à apprendre pour mieux comprendre la pharmacocinétique et la pharmacodynamique des cellules thérapeutiques administrées dans le système vivant. Pour le suivi non invasif in vivo des cellules par tomographie par émission de positons (TEP), une nouvelle méthode de radiomarquage cellulaire médiée par [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([89 Zr]Zr-DBN) a été mise au point en utilisant ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). Le présent protocole décrit un synthétison de radiomarquage [⁸⁹Zr]Zr-DBN, prêt à l’emploi, pour le radiomarquage direct de diverses cellules, y compris les cellules souches mésenchymateuses, les cellules souches cardiopoïétiques guidées par la lignée, les hépatocytes régénérant le foie, les globules blancs, les cellules de mélanome et les cellules dendritiques. La méthodologie développée permet une imagerie TEP non invasive du trafic cellulaire jusqu’à 7 jours après l’administration sans affecter la nature ou la fonction des cellules radiomarquées. De plus, ce protocole décrit une méthode par étapes pour la radiosynthèse du [89 Zr]Zr-DBN, la formulation biocompatible du [89 Zr]Zr-DBN, la préparation des cellules pour le radiomarquage, et enfin le radiomarquage des cellules avec le [⁸⁹Zr]Zr-DBN, y compris tous les détails complexes nécessaires à la réussite du radiomarquage des cellules.

Introduction

Les thérapies à base de cellules souches et de récepteurs antigéniques chimériques (CAR) à base de cellules T gagnent en popularité et font l’objet d’études actives pour le traitement de diverses maladies, telles que l’insuffisance myocardique^1,2, la dégénérescence rétinienne 2, la dégénérescence maculaire 2, le diabète ², l’infarctus du myocarde 3,4,5 et les cancers 6,7,8,9^.10. Parmi les deux approches plausibles des thérapies à base de cellules souches, les cellules souches peuvent soit être directement greffées sur le site de la maladie pour provoquer une réponse thérapeutique, soit provoquer des changements dans le microenvironnement du site de la maladie sans adhérer au site de la maladie pour initier une réponse thérapeutique indirecte. Une réponse thérapeutique indirecte pourrait provoquer des changements dans le microenvironnement du site de la maladie en libérant des facteurs qui répareraient ou traiteraient la maladie⁵. Ces approches de thérapies à base de cellules souches pourraient être évaluées par imagerie non invasive de cellules souches radiomarquées. L’imagerie non invasive pourrait corréler l’absorption des cellules radiomarquées sur le site de la maladie avec une réponse thérapeutique pour déchiffrer la réponse thérapeutique directe par rapport à la réponse thérapeutique indirecte.

De plus, des thérapies à base de cellules immunitaires sont en cours de développement pour traiter divers cancers à l’aide des cellules CAR-T 6,7,8,9,10 et de l’immunothérapie par cellules dendritiques ^11,12. D’un point de vue mécanistique, dans l’immunothérapie par cellules CAR-T 6,7,8,9,10^, les cellules T sont modifiées pour exprimer un épitope qui se lie à un antigène spécifique sur les tumeurs qui doivent être traitées. Ces cellules CAR-T modifiées, lors de l’administration, se lient à l’antigène spécifique présent sur les cellules tumorales par une interaction épitope-antigène. Après s’être liés, les cellules CAR-T liées subissent une activation, puis prolifèrent et libèrent des cytokines, ce qui signale au système immunitaire de l’hôte d’attaquer la tumeur exprimant l’antigène spécifique. En revanche, dans le cas des thérapies cellulaires dendritiques^11,12, les cellules dendritiques sont modifiées pour présenter un antigène cancéreux spécifique à leur surface. Ces cellules dendritiques modifiées, lorsqu’elles sont administrées, abritent les ganglions lymphatiques et se lient aux lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques. Les lymphocytes T, lorsqu’ils se lient aux antigènes cancéreux spécifiques sur les cellules dendritiques administrées, subissent une activation/prolifération et initient une réponse immunitaire de l’hôte contre la tumeur exprimant cet antigène spécifique. Par conséquent, l’évaluation du trafic des cellules CAR-T administrées vers un site tumoral^9,10 et de la localisation des cellules dendritiques vers les ganglions lymphatiques^11,12 est possible par imagerie de cellules CAR-T et de cellules dendritiques radiomarquées pour déterminer l’efficacité de l’immunothérapie. De plus, le trafic cellulaire non invasif peut aider à mieux comprendre le potentiel thérapeutique, à clarifier la réponse thérapeutique directe par rapport à la réponse thérapeutique indirecte, et à prédire et surveiller la réponse thérapeutique des thérapies à base de cellules souches et de cellules immunitaires.

Différentes modalités d’imagerie pour le trafic cellulaire ont été explorées 3,4,9,10,12, notamment l’imagerie optique^, l’imagerie par résonance magnétique (IRM), la tomographie par émission monophotonique (SPECT) et la tomographie par émission de positons (TEP). Chacune de ces techniques a ses propres avantages et inconvénients. Parmi celles-ci, la TEP est la modalité la plus prometteuse en raison de sa nature quantitative et de sa haute sensibilité, qui sont essentielles pour la quantification fiable des cellules dans le trafic cellulaire basé sur l’imagerie 3,4,9,10.

Le radio-isotope émetteur de positons ⁸⁹Zr, d’une demi-vie de 78,4 h, est adapté au marquage cellulaire. Il permet l’imagerie TEP du trafic cellulaire pendant plus d’une semaine et est facilement produit par des cyclotrons médicaux à faible consommation d’énergie^largement disponibles 13,14,15,16,17. De plus, un chélateur p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine (DFO-Bn-NCS) fonctionnalisé de manière appropriée est disponible dans le commerce pour la synthèse d’un synthon de marquage cellulaire prêt à l’emploi et marqué au 89 Zr, [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, également connu sous le nom de [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Le principe du marquage cellulaire médié par [89 Zr]Zr-DBN est basé sur une réaction entre les amines primaires des protéines de la membrane cellulaire et la fraction isothiocyanate (NCS) de [⁸⁹Zr]Zr-DBN pour produire une liaison thiourée covalente stable.

[⁸⁹Zr] Le marquage et l’imagerie cellulaires basés sur Zr-DBN ont été publiés pour suivre une variété de cellules différentes, y compris les cellules souches 18,23,25, les cellules dendritiques¹⁸, les cellules souches cardiopoïétiques¹⁹, les cellules stromales déciduales 20, les macrophages dérivés de la moelle osseuse 20, les cellules mononucléées du sang périphérique 20, les cellules Jurkat/CAR-T 21, les hépatocytes ^22,24 et les globules blancs ²⁵. Le protocole suivant fournit des méthodes étape par étape de préparation et de radiomarquage cellulaire avec [⁸⁹Zr]Zr-DBN et décrit les modifications qui peuvent être nécessaires dans le protocole de radiomarquage pour un type cellulaire spécifique. Pour plus de clarté, la méthode de radiomarquage cellulaire présentée ici est divisée en quatre sections. La première section traite de la préparation de [89 Zr]Zr-DBN par chélation de ⁸⁹Zr avec le MPO-Bn-NCS. La deuxième section décrit la préparation d’une formulation biocompatible de [⁸⁹Zr]Zr-DBN qui peut être facilement utilisée pour le radiomarquage cellulaire. La troisième section couvre les étapes nécessaires au préconditionnement des cellules pour le radiomarquage. Le préconditionnement des cellules consiste à laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans protéines et une solution saline équilibrée de Hanks tamponnée HEPES (H-HBSS) pour éliminer les protéines externes, qui pourraient interférer ou entrer en compétition avec la réaction du [⁸⁹Zr]Zr-DBN avec les amines primaires présentes sur les protéines de surface cellulaires pendant le radiomarquage. La dernière section présente les étapes du radiomarquage proprement dit des cellules et de l’analyse du contrôle de la qualité.

Protocol

Des cellules dendritiques et des cellules de mélanome ont été obtenues commercialement18. Des hépatocytes ont été isolés du foie de porcs après hépatectomie partielle laparoscopique22,24. Des cellules souches ont été isolées à partir d’échantillons de moelle osseuse18,19,26. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux ont ét?…

Representative Results

Les résultats représentatifs présentés dans ce manuscrit ont été compilés à partir des études précédentes de synthèse [89Zr]Zr-DBN et de radiomarquage cellulaire 18,19,22,23,24,25. En bref, le 89Zr peut être complexé avec succès avec le DFO-Bn-NCS en ~30 à 60 min à 25-37 °C en utilisant…

Discussion

Voici les étapes critiques du protocole qui doivent être optimisées pour un radiomarquage cellulaire efficace. Aux étapes 1.2 et 1.3 du protocole, en fonction du volume de [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ ou [⁸⁹Zr]ZrCl₄ utilisé, un volume approprié (microlitres) de base doit être utilisé ; La solution de CO 3 1,0 M_K2 doit être utilisée pour la neutralisation de la solution de [89 Zr]Zr(HPO 4)2 et la solution de 1,0 M Na₂ CO <su…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG