세포 이동의 양전자 방출 단층 촬영 이미징: 세포 방사선 표지 방법
Summary
여기에 제시된 것은 바로 사용할 수 있는 방사성 표지 합성 [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine([89Zr]Zr-DBN)을 사용하여 양전자 방출 단층 촬영(PET) 방사성 동위원소, 89Zr(t1/2 78.4 h)로 세포를 방사성 표지하는 프로토콜입니다. [89Zr]Zr-DBN을 사용한 방사성 표지 세포는 투여 후 최대 7일 동안 PET를 사용하여 체내에서 투여된 방사성 표지 세포의 비침습적 추적 및 이미징을 가능하게 합니다.
Abstract
줄기세포 및 키메라 항원 수용체(CAR) T세포 치료제는 장기 재생을 위한 유망한 치료제이자 다양한 암에 대한 면역 요법으로 부상하고 있습니다. 이러한 분야에서 상당한 진전이 이루어졌음에도 불구하고 살아있는 시스템에서 투여된 치료 세포의 약동학 및 약력학을 더 잘 이해하기 위해서는 아직 더 많은 것을 배워야 합니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용한 세포의 비침습적 생체 내 추적을 위해 89Zr(t1/2 78.4h)을 사용하여 새로운 [89 Zr]Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine([89Zr]Zr-DBN) 매개 세포 방사선 표지 방법이 개발되었습니다. 본 프로토콜은 중간엽 줄기세포, 계통 유도 심근세포, 간 재생 간세포, 백혈구, 흑색종 세포 및 수지상세포를 포함한 다양한 세포의 직접 방사선표지를 위한 [89Zr]Zr-DBN-매개 즉시 사용 가능한 방사선표지 합성을 기술한다. 개발된 방법론은 방사성 표지된 세포의 특성이나 기능에 영향을 미치지 않고 투여 후 최대 7일 동안 세포 이동에 대한 비침습적 PET 이미징을 가능하게 합니다. 또한, 이 프로토콜은 [89 Zr]Zr-DBN의 방사성 합성, [89 Zr]Zr-DBN의 생체적합성 제형, 방사성 표지를 위한 세포 준비, 그리고 마지막으로 세포의 성공적인 방사성 표지에 필요한 모든 복잡한 세부 사항을 포함하여 [89Zr]Zr-DBN을 사용한 세포의 방사성 표지를 위한 단계적 방법을 설명합니다.
Introduction
줄기세포와 키메라 항원 수용체(CAR) T세포 치료제는 심근부전1,2, 망막변성2, 황반변성2, 당뇨병2, 심근경색3,4,5, 암6,7,8,9 등 다양한 질병의 치료를 위해 활발히 연구되고 있다.10. 줄기세포 치료의 두 가지 그럴듯한 접근법 중 줄기세포를 질병 부위에 직접 생착시켜 치료적 반응을 일으키거나, 질병 부위에 부착하지 않고 질병 부위의 미세환경을 변화시켜 간접적인 치료적 반응을 일으킬 수 있다. 간접적인 치료적 반응은 질병을 복구하거나 치료할 수 있는 인자를 방출함으로써 질병 부위의 미세환경에 변화를 일으킬 수 있다5. 줄기 세포 치료의 이러한 접근 방식은 방사선 표지 줄기 세포의 비침습적 이미징으로 평가할 수 있습니다. 비침습적 영상은 질병 부위의 방사성 표지된 세포의 흡수와 치료 반응의 상관관계를 파악하여 직접 및 간접 치료 반응을 해독할 수 있습니다.
또한 CAR T-cell 6,7,8,9,10 및 수지상세포 면역요법 11,12를 이용하여 다양한 암을 치료하기 위한 면역세포 기반 치료제가 개발되고 있습니다. 기계학적으로 CAR T 세포 면역 요법 6,7,8,9,10에서 T 세포는 치료가 필요한 종양의 특정 항원에 결합하는 에피토프를 발현하도록 조작됩니다. 이렇게 조작된 CAR T세포는 투여 시 에피토프-항원 상호작용을 통해 종양 세포에 존재하는 특정 항원에 결합합니다. 결합 후 결합된 CAR T 세포는 활성화된 후 증식하여 사이토카인을 방출하는데, 이는 숙주의 면역 체계에 신호를 보내 특정 항원을 발현하는 종양을 공격하도록 합니다. 대조적으로, 수지상 세포 치료제(11,12)의 경우, 수지상 세포는 표면에 특정 암 항원을 제시하도록 조작된다. 이렇게 조작된 수지상세포는 투여될 때 림프절의 본거지이며 림프절의 T 세포에 결합합니다. T-세포는 투여된 수지상세포의 특정 암 항원에 결합하면 활성화/증식을 거쳐 특정 항원을 발현하는 종양에 대한 숙주의 면역 반응을 시작합니다. 따라서, 면역요법의 효능을 결정하기 위해 방사선 표지된 CAR T-세포 및 수지상세포를 이미징함으로써 투여된 CAR T-세포의 종양 부위(9,10)로의 이동(trafficking) 및 림프절(11,12)로의 수지상세포(homing)에 대한 평가가 가능하다. 또한 비침습적 세포 이동은 치료 가능성을 더 잘 이해하고, 직접 및 간접 치료 반응을 명확히 하고, 줄기 세포 및 면역 세포 기반 치료의 치료 반응을 예측 및 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다.
광학 영상, 자기 공명 영상(MRI), 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영(SPECT) 및 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 포함하여 세포 이동을 위한 다양한 이미징 양식이 3,4,9,10,12로 탐색되었습니다. 이러한 각 기술에는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 이 중 PET는 정량적 특성과 높은 감도로 인해 가장 유망한 양식이며, 이는 이미징 기반 세포 매매 3,4,9,10에서 세포의 신뢰할 수 있는 정량화에 필수적입니다.
반감기가 78.4시간인 양전자 방출 방사성 동위원소 89Zr은 세포 표지에 적합합니다. 1주일 이상 세포 이동의 PET 이미징을 가능하게 하며 널리 사용되는 저에너지 의료용 사이클로트론 13,14,15,16,17에 의해 쉽게 생성됩니다. 또한, 적절하게 기능화된 p-이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민(DFO-Bn-NCS) 킬레이터는 [89Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24 로도 알려진 89 Zr-표지 된, 즉시 사용 가능한 세포 표지 합성, [89Zr]Zr-p-이소티오시아나토벤질-데스페리옥사민의 합성을 위해 상업적으로 이용 가능합니다,25. [89Zr]Zr-DBN 매개 세포 표지의 원리는 세포막 단백질의 1차 아민과 [89Zr]Zr-DBN의 이소티오시아네이트(NCS) 부분 사이의 반응을 기반으로 하여 안정적인 공유 티오우레아 결합을 생성합니다.
[89Zr] Zr-DBN 기반 세포 표지 및 이미징은 줄기 세포 18,23,25, 수지상 세포18, 심장 줄기 세포19, 낙엽 기질 세포 20, 골수 유래 대식 세포 20, 말초 혈액 단핵 세포 20, Jurkat/CAR T 세포 21, 간세포22,24 및 백혈 구 25를 포함한 다양한 세포를 추적하기 위해 발표되었습니다. 다음 프로토콜은 [89Zr]Zr-DBN을 사용한 세포 방사선 표지 준비 및 세포 표지의 단계별 방법을 제공하고 특정 세포 유형에 대한 방사선 표지 프로토콜에서 필요할 수 있는 변경 사항을 설명합니다. 보다 명확성을 높이기 위해 여기에 제시된 세포 방사성 표지 방법은 4개의 섹션으로 나뉩니다. 첫 번째 섹션에서는 DFO-Bn-NCS로 89 Zr을 킬레이트하여 [89Zr]Zr-DBN을 제조하는 방법을 다룹니다. 두 번째 섹션에서는 세포 방사선 표지에 쉽게 사용할 수 있는 [89Zr]Zr-DBN의 생체 적합성 제형의 제조에 대해 설명합니다. 세 번째 섹션에서는 방사선 표지를 위한 세포의 전처리에 필요한 단계를 다룹니다. 세포의 전처리는 방사선 표지 중 세포 표면 단백질에 존재하는 일차 아민과 [89Zr]Zr-DBN의 반응을 방해하거나 경쟁할 수 있는 외부 단백질을 제거하기 위해 단백질이 없는 인산염 완충 식염수(PBS) 및 HEPES 완충 행크스 균형염 용액(H-HBSS)으로 세포를 세척하는 것을 포함합니다. 마지막 섹션에서는 세포의 실제 방사성 표지 및 품질 관리 분석과 관련된 단계를 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다음은 효과적인 세포 방사선 표지를 위해 최적화가 필요한 프로토콜의 중요한 단계입니다. 프로토콜 단계 1.2 및 1.3에서 사용된 [89 Zr]Zr(HPO 4)2 또는 [89Zr]ZrCl 4의 부피에 따라 적절한 부피(마이크로리터)의 베이스를 사용해야 합니다. pH 7.5-8.0의 pH 범위를 달성하기 위해 [89 Zr]Zr(HPO 4)2의 중화에는 1.0M K 2 CO 3 용액을 사용하고 [89Zr] ZrCl4?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH 5R21HL127389-02, NIH 4T32HL007111-39, NIH R01HL134664 및 DOE DE-SC0008947 보조금, 비엔나 국제원자력기구(International Atomic Energy Agency), 메이요 클리닉 핵의학과(Mayo Clinic Division of Nuclear Medicine), 방사선과, 미네소타주 로체스터(Rochester, MÓN)의 메이요 클리닉 재생 의학 센터(Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine)의 지원을 받았습니다. 모든 피규어는 BioRender.com 를 사용하여 만들어졌습니다.
Materials
| Acetonitrile | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A996-4 | |
| Alpha Minimum Essential Medium | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 12571063 | |
| Anion exchange column | Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany | 731876 | Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge |
| Conical centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc., Glendale, AZ, USA | 352096 | Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes |
| Dendritic cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-11904 | |
| DFO-Bn-NCS | Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA | B-705 | p-SCN-Bn-Deferoxamine |
| DMSO | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 276855 | |
| Dose calibrator | Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA | 5130-3234 | CRC -55tR Dose Calibrator |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | 30-2020 | |
| Hanks Balanced Salt solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 14025092 | For preparation of H-HBSS |
| Hydrochloric Acid (trace metal basis grade) | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | A508P212 | |
| Melanoma cells | The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL-6475 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO | 34860 | |
| Microcentrifuge tube | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30108442 | Protein LoBind microcentrifuge tube |
| Murine GM-CSF | R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA | 415-ML-010 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 15140-122 | |
| Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA | 10010023 | For washing cells |
| Saline | Covidien LLC, Mansfield, MA, USA | 1020 | 0.9% Sterile Saline Solution |
| Shaker | Eppendorf, Hamburg, Germany | T1317 | Thermomixer |
| Silica gel-rad-TLC paper sheet | Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA | SGI0001 | iTLC-SG |
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