Positronemissionstomografi Imaging af cellehandel: En metode til celleradiomærkning

Summary

Præsenteret her er en protokol til radiolabelceller med en positronemissionstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t_1/2 78,4 h), ved hjælp af en brugsklar radiomærkningssynthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([⁸⁹Zr] Zr-DBN). Radioaktive mærkningsceller med [⁸⁹Zr] Zr-DBN tillader ikke-invasiv sporing og billeddannelse af administrerede radioaktivt mærkede celler i kroppen med PET i op til 7 dage efter administration.

Abstract

Stamcelle- og kimære antigenreceptor (CAR) T-celleterapier fremstår som lovende behandlinger til organregenerering og som immunterapi til forskellige kræftformer. På trods af at der er gjort betydelige fremskridt på disse områder, er der stadig mere at lære for bedre at forstå farmakokinetikken og farmakodynamikken af de administrerede terapeutiske celler i det levende system. Til ikke-invasiv in vivo-sporing af celler med positronemissionstomografi (PET) er der udviklet en ny [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin ([89 Zr] Zr-DBN) -medieret celleradiomærkningsmetode ved hjælp af ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 timer). Denne protokol beskriver en [⁸⁹Zr] Zr-DBN-medieret, klar til brug, radiomærkning synthon til direkte radiomærkning af forskellige celler, herunder mesenkymale stamceller, afstamningsstyrede kardiopoietiske stamceller, leverregenererende hepatocytter, hvide blodlegemer, melanomceller og dendritiske celler. Den udviklede metode muliggør ikke-invasiv PET-billeddannelse af cellehandel i op til 7 dage efter administration uden at påvirke arten eller funktionen af de radioaktivt mærkede celler. Derudover beskriver denne protokol en trinvis metode til radiosyntese af [89 Zr] Zr-DBN, biokompatibel formulering af [89 Zr] Zr-DBN, forberedelse af celler til radioaktiv mærkning og endelig radiomærkning af celler med [⁸⁹Zr] Zr-DBN, herunder alle de indviklede detaljer, der er nødvendige for en vellykket radiomærkning af celler.

Introduction

Stamcelle- og kimær antigenreceptor (CAR) T-celleterapier vinder popularitet og er under aktiv undersøgelse til behandling af forskellige sygdomme, såsom myokardiesvigt^1,2, retinal degeneration 2, makuladegeneration 2, diabetes ², myokardieinfarkt^3,4,5 og kræft ^6,7,8,9,10. Blandt de to plausible tilgange til stamcelleterapier kan stamceller enten podes direkte på sygdomsstedet for at forårsage en terapeutisk reaktion eller forårsage ændringer i sygdomsstedets mikromiljø uden at klæbe til sygdomsstedet for at indlede en indirekte terapeutisk respons. En indirekte terapeutisk reaktion kan forårsage ændringer i mikromiljøet på sygdomsstedet ved at frigive faktorer, der ville reparere eller behandle sygdommen⁵. Disse tilgange til stamcelleterapier kunne evalueres ved ikke-invasiv billeddannelse af radioaktivt mærkede stamceller. Ikke-invasiv billeddannelse kunne korrelere optagelsen af de radioaktivt mærkede celler på sygdomsstedet med et terapeutisk respons for at dechiffrere det direkte versus indirekte terapeutiske respons.

Derudover udvikles immuncellebaserede terapier til behandling af forskellige kræftformer ved hjælp af CAR T-celle 6,7,8,9,10 og dendritisk celleimmunterapi ^11,12. Mekanisk er T-celler i CAR T-celleimmunterapi 6,7,8,9,10 konstrueret til at udtrykke en epitop, der binder til et specifikt antigen på tumorer, der skal behandles. Disse konstruerede CAR T-celler binder ved administration til det specifikke antigen, der er til stede på tumorcellerne gennem en epitop-antigeninteraktion. Efter binding gennemgår de bundne CAR T-celler aktivering og prolifererer derefter og frigiver cytokiner, hvilket signalerer værtsens immunsystem til at angribe tumoren, der udtrykker det specifikke antigen. I modsætning hertil er dendritiske celler i tilfælde af dendritiske celleterapier^11,12 konstrueret til at præsentere et specifikt kræftantigen på deres overflade. Disse konstruerede dendritiske celler, når de administreres, hjem til lymfeknuderne og binder til T-cellerne i lymfeknuderne. T-cellerne, efter binding til de specifikke kræftantigener på de administrerede dendritiske celler, gennemgår aktivering / proliferation og initierer et immunrespons fra værten mod tumoren, der udtrykker det specifikke antigen. Derfor er vurderingen af handel med administrerede CAR T-celler til et tumorsted^9,10 og homing af dendritiske celler til lymfeknuderne^11,12 mulig ved billeddannelse af radioaktivt mærkede CAR T-celler og dendritiske celler for at bestemme effekten af immunterapi. Desuden kan ikke-invasiv cellehandel bidrage til bedre at forstå det terapeutiske potentiale, afklare det direkte versus indirekte terapeutiske respons og forudsige og overvåge det terapeutiske respons af både stamcelle- og immuncellebaserede terapier.

Forskellige billeddannelsesmetoder til cellehandel er blevet undersøgt 3,4,9,10,12, herunder optisk billeddannelse^, magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), computertomografi med en fotonemission (SPECT) og positronemissionstomografi (PET). Hver af disse teknikker har sine egne fordele og ulemper. Blandt disse er PET den mest lovende modalitet på grund af dens kvantitative karakter og høje følsomhed, som er afgørende for pålidelig kvantificering af celler i billeddannelsesbaseret cellehandel 3,4,9,10.

Den positronemitterende radioisotop ⁸⁹Zr, med en halveringstid på 78, 4 timer, er egnet til cellemærkning. Det tillader PET-billeddannelse af cellehandel i over 1 uge og produceres let af bredt tilgængelige, lavenergi medicinske cyklotroner 13,14,15,16,17. Derudover er en passende funktionaliseret, p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) chelator kommercielt tilgængelig til syntese af en 89 Zr-mærket, klar til brug, cellemærkningssynthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamin, også kendt som [⁸⁹Zr] Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Princippet om [89 Zr] Zr-DBN-medieret cellemærkning er baseret på en reaktion mellem primære aminer af cellemembranproteiner og isothiocyanatdelen (NCS) af [⁸⁹Zr] Zr-DBN for at producere en stabil kovalent thiourea-binding.

[⁸⁹Zr] Zr-DBN-baseret cellemærkning og billeddannelse er blevet offentliggjort for at spore en række forskellige celler, herunder stamceller 18,23,25, dendritiske celler¹⁸, kardiopoietiske stamceller¹⁹, decidual stromale celler 20, knoglemarvsafledte makrofager 20, mononukleære celler i perifert blod 20, Jurkat / CAR T-celler 21, hepatocytter ^22,24 og hvide blodlegemer ²⁵. Følgende protokol indeholder trinvise metoder til forberedelse og celleradiomærkning med [⁸⁹Zr] Zr-DBN og beskriver ændringer, der kan være nødvendige i radiomærkningsprotokollen for en bestemt celletype. For større klarhed er metoden til celleradiomærkning præsenteret her opdelt i fire sektioner. Det første afsnit omhandler forberedelsen af [89 Zr]Zr-DBN ved chelatering af ⁸⁹Zr med DFO-Bn-NCS. Det andet afsnit beskriver fremstillingen af en biokompatibel formulering af [⁸⁹Zr]Zr-DBN, der let kan anvendes til celleradiomærkning. Det tredje afsnit dækker de trin, der er nødvendige for forkonditionering af celler til radioaktiv mærkning. Forkonditioneringen af celler involverer vask af cellerne med proteinfri fosfatbufret saltvand (PBS) og HEPES-bufret Hanks afbalanceret saltopløsning (H-HBSS) for at fjerne eksterne proteiner, som kan forstyrre eller konkurrere med reaktionen af [⁸⁹Zr] Zr-DBN med primære aminer til stede på celleoverfladeproteinerne under radiomærkning. Det sidste afsnit indeholder trin, der er involveret i den faktiske radioaktive mærkning af cellerne og kvalitetskontrolanalyse.

Protocol

Dendritiske celler og melanomceller blev opnået kommercielt18. Hepatocytter blev isoleret fra leveren hos svin efter laparoskopisk partiel hepatektomi22,24. Stamceller blev isoleret fra knoglemarvsaspirater18,19,26. De fedtvævsafledte stamceller blev opnået fra Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. …

Representative Results

De repræsentative resultater præsenteret i dette manuskript blev samlet fra de tidligere [89Zr] Zr-DBN syntese og celle radiomærkning undersøgelser 18,19,22,23,24,25. Kort fortalt kan 89Zr med succes kompleksiseres med DFO-Bn-NCS på ~30-60 min ved 25-37 °C ved hjælp af 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (<stro…

Discussion

Følgende er kritiske trin i protokollen, der har brug for optimering til effektiv celleradiomærkning. I protokoltrin 1.2 og 1.3 skal der afhængigt af det anvendte volumen på [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ eller [⁸⁹Zr]ZrCl₄ anvendes et passende volumen (mikroliter) base; 1,0 M_K2CO3 opløsning skal anvendes til neutralisering af [89 Zr]Zr(HPO 4)2 og 1,0 M Na ₂ CO₃ opløsning til neutralisering af [⁸⁹Zr]ZrCl_4…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG