Positronutslippstomografi Avbildning av cellehandel: En metode for celleradiomerking

Summary

Presentert her er en protokoll til radiolabel celler med en positronemisjonstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t_1/2 78,4 h), ved hjelp av en klar til bruk radiomerking synton, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine ([⁸⁹Zr] Zr-DBN). Radiomerking av celler med [⁸⁹Zr]Zr-DBN tillater ikke-invasiv sporing og avbildning av administrerte radiomerkede celler i kroppen med PET i opptil 7 dager etter administrering.

Abstract

Stamcelle- og kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapier fremstår som lovende terapeutiske midler for organregenerering og som immunterapi for ulike kreftformer. Til tross for at det er gjort betydelige fremskritt på disse områdene, er det fortsatt mer å lære for bedre å forstå farmakokinetikken og farmakodynamikken til de administrerte terapeutiske cellene i det levende systemet. For ikke-invasiv, in vivo sporing av celler med positronemisjonstomografi (PET), er det utviklet en ny [89 Zr] Zr-p-isotiocyanatobenzyl-desferrioksamin ([89 Zr]Zr-DBN)-mediert celleradiomerkingsmetode ved bruk av ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 timer). Den foreliggende protokollen beskriver en [⁸⁹Zr]Zr-DBN-mediert, klar til bruk, radiomerkingssynthon for direkte radiomerking av forskjellige celler, inkludert mesenkymale stamceller, avstamningsveiledede kardiopoietiske stamceller, leverregenererende hepatocytter, hvite blodlegemer, melanomceller og dendrittiske celler. Den utviklede metoden muliggjør ikke-invasiv PET-avbildning av celletrafikk i opptil 7 dager etter administrering uten å påvirke naturen eller funksjonen til de radiomerkede cellene. I tillegg beskriver denne protokollen en trinnvis metode for radiosyntese av [89 Zr] Zr-DBN, biokompatibel formulering av [89 Zr] Zr-DBN, fremstilling av celler for radiomerking, og til slutt radiomerking av celler med [⁸⁹Zr] Zr-DBN, inkludert alle de intrikate detaljene som trengs for vellykket radiomerking av celler.

Introduction

Stamcelle- og kimær antigenreseptor (CAR) T-celleterapier blir stadig mer populære og er under aktiv etterforskning for behandling av ulike sykdommer, som myokardsvikt^1,2, retinal degenerasjon 2, makuladegenerasjon 2, diabetes ², hjerteinfarkt^3,4,5 og kreft ^6,7,8,9,10. Blant de to plausible tilnærmingene til stamcellebehandlinger, kan stamceller enten bli direkte innpodet på sykdomsstedet for å forårsake en terapeutisk respons, eller forårsake endringer i mikromiljøet på sykdomsstedet uten å feste seg til sykdomsstedet for å initiere en indirekte terapeutisk respons. En indirekte terapeutisk respons kan forårsake endringer i mikromiljøet på sykdomsstedet ved å frigjøre faktorer som vil reparere eller behandle sykdommen⁵. Disse tilnærmingene til stamcellebehandlinger kan evalueres ved ikke-invasiv avbildning av radiomerkede stamceller. Ikke-invasiv avbildning kan korrelere opptaket av de radiomerkede cellene på sykdomsstedet med en terapeutisk respons for å dechiffrere den direkte versus indirekte terapeutiske responsen.

I tillegg utvikles immuncellebaserte terapier for å behandle ulike kreftformer ved bruk av CAR T-celle 6,7,8,9,10 og dendrittisk celleimmunterapi ^11,12. Mekanistisk, i CAR T-celle immunterapi 6,7,8,9,10^, er T-celler konstruert for å uttrykke en epitop som binder seg til et spesifikt antigen på svulster som må behandles. Disse konstruerte CAR T-cellene, ved administrering, binder seg til det spesifikke antigenet som er tilstede på tumorcellene gjennom en epitop-antigen-interaksjon. Etter binding gjennomgår de bundne CAR T-cellene aktivering og prolifererer og frigjør cytokiner, som signaliserer vertens immunsystem for å angripe svulsten som uttrykker det spesifikke antigenet. I kontrast, når det gjelder dendritiske celleterapier^11,12, er dendrittiske celler konstruert for å presentere et spesifikt kreftantigen på overflaten. Disse konstruerte dendrittiske cellene, når de administreres, hjem til lymfeknuter og binder seg til T-cellene i lymfeknuter. T-cellene, ved binding til de spesifikke kreftantigenene på de administrerte dendrittiske cellene, gjennomgår aktivering / proliferasjon og initierer en immunrespons av verten mot svulsten som uttrykker det spesifikke antigenet. Derfor er vurderingen av trafikk av administrerte CAR T-celler til et tumorsted 9,10 og homing av dendrittiske celler til lymfeknuter^11,12 mulig ved å avbilde radiomerkede CAR T-celler og dendrittiske celler for å bestemme effekten av immunterapi. Videre kan ikke-invasiv cellehandel bidra til å bedre forstå det terapeutiske potensialet, klargjøre den direkte versus indirekte terapeutiske responsen, og forutsi og overvåke den terapeutiske responsen til både stamcelle- og immuncellebaserte terapier.

Ulike bildebehandlingsmodaliteter for cellehandel har blitt utforsket 3,4,9,10,12, inkludert optisk bildebehandling^, magnetisk resonansavbildning (MRI), enkelt-foton emisjonscomputertomografi (SPECT) og positronemisjonstomografi (PET). Hver av disse teknikkene har sine egne fordeler og ulemper. Blant disse er PET den mest lovende modaliteten på grunn av sin kvantitative natur og høye følsomhet, som er avgjørende for pålitelig kvantifisering av celler i bildebasert cellehandel 3,4,9,10.

Den positronemitterende radioisotopen ⁸⁹Zr, med en halveringstid på 78,4 timer, er egnet for cellemerking. Det tillater PET-avbildning av cellehandel i over 1 uke og produseres lett av allment tilgjengelige, medisinske syklotroner med lav energi 13,14,15,16,17. I tillegg er en passende funksjonalisert, p-isotiocyanatobenzyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) chelator kommersielt tilgjengelig for syntesen av en 89 Zr-merket, klar til bruk, cellemerking synthon, [89 Zr] Zr-p-isothiocyanatobenzyl-desferrioxamine, også kjent som [⁸⁹Zr] Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Prinsippet for [89 Zr]Zr-DBN-mediert cellemerking er basert på en reaksjon mellom primære aminer av cellemembranproteiner og isotiocyanatdelen (NCS) av [⁸⁹Zr]Zr-DBN for å produsere en stabil kovalent tioureabinding.

[⁸⁹Zr] Zr-DBN-basert cellemerking og avbildning har blitt publisert for å spore en rekke forskjellige celler, inkludert stamceller 18,23,25, dendrittiske celler¹⁸, kardiopoietiske stamceller¹⁹, decidual stromale celler 20, benmargsavledede makrofager 20, mononukleære celler i perifert blod 20, Jukat / CAR T-celler 21, hepatocytter^22,24 og hvite blodlegemer ²⁵. Følgende protokoll gir trinnvise metoder for fremstilling og celleradiomerking med [⁸⁹Zr]Zr-DBN og beskriver endringer som kan være nødvendige i radiomerkingsprotokollen for en bestemt celletype. For større klarhet er metoden for cellemerking presentert her delt inn i fire seksjoner. Den første delen omhandler utarbeidelsen av [89 Zr]Zr-DBN ved å chelatere ⁸⁹Zr med DFO-Bn-NCS. Den andre delen beskriver fremstillingen av en biokompatibel formulering av [⁸⁹Zr]Zr-DBN som lett kan brukes til celleradiomerking. Den tredje delen dekker trinnene som er nødvendige for forkondisjonering av celler for radiomerking. Forkondisjoneringen av celler innebærer å vaske cellene med proteinfritt fosfatbufret saltvann (PBS) og HEPES bufret Hanks balansert saltløsning (H-HBSS) for å fjerne eksterne proteiner, som kan forstyrre eller konkurrere med reaksjonen av [⁸⁹Zr] Zr-DBN med primære aminer tilstede på celleoverflateproteiner under radiomerking. Den siste delen gir trinn involvert i selve radiomerkingen av cellene og kvalitetskontrollanalyse.

Protocol

Dendrittiske celler og melanomceller ble oppnådd kommersielt18. Hepatocytter ble isolert fra leveren hos griser etter laparoskopisk partiell hepatektomi22,24. Stamceller ble isolert fra benmargsaspirater18,19,26. De fettvevsavledede stamcellene ble hentet fra Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Huma…

Representative Results

De representative resultatene som presenteres i dette manuskriptet er utarbeidet fra tidligere [89Zr]Zr-DBN syntese- og celleradiomerkingsstudier 18,19,22,23,24,25. Kort fortalt kan 89Zr med hell komplekseres med DFO-Bn-NCS i ~30-60 min ved 25-37 °C ved bruk av 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (tabell 2</s…

Discussion

Følgende er kritiske trinn i protokollen som trenger optimalisering for effektiv cellemerking. I protokolltrinn 1.2 og 1.3, avhengig av volumet på [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ eller [⁸⁹Zr]ZrCl₄ anvendt, må et passende volum (mikroliter) base brukes; 1,0 M K 2 CO 3løsning må brukes til nøytralisering av [89 Zr] Zr (HPO 4) 2 og 1,0 M Na₂CO ₃ løsning for nøytralisering av [⁸⁹Zr] ZrCl₄ for å oppn?…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG