Positronemissionstomografiavbildning av celltrafik: En metod för cellradiomärkning

Summary

Här presenteras ett protokoll för radiomärkning av celler med en positronemissionstomografi (PET) radioisotop, 89 Zr (t_1/2 78,4 h), med användning av en radioaktivt märkande synton som är färdig att använda, [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin ([⁸⁹Zr]Zr-DBN). Radiomärkning av celler med [⁸⁹Zr]Zr-DBN möjliggör icke-invasiv spårning och avbildning av administrerade radiomärkta celler i kroppen med PET i upp till 7 dagar efter administrering.

Abstract

T-cellsterapier med stamceller och chimära antigenreceptorer (CAR) håller på att utvecklas till lovande terapier för organregenerering och som immunterapi för olika cancerformer. Trots att betydande framsteg har gjorts inom dessa områden finns det fortfarande mer att lära för att bättre förstå farmakokinetiken och farmakodynamiken hos de administrerade terapeutiska cellerna i det levande systemet. För icke-invasiv, in vivo-spårning av celler med positronemissionstomografi (PET) har en ny [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin ([89 Zr]Zr-DBN)-medierad cellradiomärkningsmetod utvecklats med användning av ⁸⁹Zr (t_1/2 78,4 h). Det aktuella protokollet beskriver en [⁸⁹Zr]Zr-DBN-medierad, färdig att använda, radiomärkningssynton för direkt radiomärkning av olika celler, inklusive mesenkymala stamceller, linjestyrda kardiopoetiska stamceller, leverregenererande hepatocyter, vita blodkroppar, melanomceller och dendritiska celler. Den utvecklade metodiken möjliggör icke-invasiv PET-avbildning av celltrafik i upp till 7 dagar efter administrering utan att påverka de radiomärkta cellernas natur eller funktion. Dessutom beskriver detta protokoll en stegvis metod för radiosyntes av [89 Zr]Zr-DBN, biokompatibel formulering av [89 Zr]Zr-DBN, beredning av celler för radiomärkning och slutligen radiomärkning av celler med [⁸⁹Zr]Zr-DBN, inklusive alla intrikata detaljer som behövs för framgångsrik radiomärkning av celler.

Introduction

Stamcells- och chimär antigenreceptor (CAR) T-cellsterapier blir allt populärare och undersöks aktivt för behandling av olika sjukdomar, såsom myokardsvikt^1,2, näthinnedegeneration 2, makuladegeneration 2, diabetes ², hjärtinfarkt 3,4,5 och cancer 6,7,8,9^,10. Bland de två troliga tillvägagångssätten för stamcellsterapier kan stamceller antingen transplanteras direkt på sjukdomsstället för att orsaka ett terapeutiskt svar, eller orsaka förändringar i mikromiljön på sjukdomsstället utan att fästa vid sjukdomsstället för att initiera ett indirekt terapeutiskt svar. Ett indirekt terapeutiskt svar kan orsaka förändringar i mikromiljön på sjukdomsstället genom att frigöra faktorer som skulle reparera eller^{behandla sjukdomen.} Dessa metoder för stamcellsterapier kan utvärderas genom icke-invasiv avbildning av radioaktivt märkta stamceller. Icke-invasiv avbildning kan korrelera upptaget av de radioaktivt märkta cellerna på sjukdomsstället med ett terapeutiskt svar för att dechiffrera det direkta kontra indirekta terapeutiska svaret.

Dessutom utvecklas immuncellsbaserade terapier för att behandla olika cancerformer med hjälp av CAR T-cell 6,7,8,9,10 och dendritisk cellimmunterapi ^11,12. Mekanistiskt, i CAR T-cellsimmunterapi 6,7,8,9,10^, är T-celler konstruerade för att uttrycka en epitop som binder till ett specifikt antigen på tumörer som behöver behandlas. Dessa modifierade CAR T-celler binder vid administrering till det specifika antigen som finns på tumörcellerna genom en epitop-antigeninteraktion. Efter bindning aktiveras de bundna CAR T-cellerna och förökar sig sedan och frisätter cytokiner, som signalerar till värdens immunsystem att attackera tumören som uttrycker det specifika antigenet. Däremot, när det gäller dendritiska cellterapier^11,12, är dendritiska celler konstruerade för att presentera ett specifikt cancerantigen på sin yta. Dessa modifierade dendritiska celler, när de administreras, hem till lymfkörtlarna och binder till T-cellerna i lymfkörtlarna. T-cellerna aktiveras/prolifereras och initierar ett immunsvar hos värden mot tumören som uttrycker det specifika antigenet, när de binder till de specifika cancerantigenerna på de administrerade dendritiska cellerna. Därför är det möjligt att bedöma smuggling av administrerade CAR T-celler till ett tumörställe^9,10 och målsökning av dendritiska celler till lymfkörtlarna^11,12 genom att avbilda radiomärkta CAR T-celler och dendritiska celler för att bestämma effekten av immunterapi. Dessutom kan icke-invasiv celltrafik bidra till att bättre förstå den terapeutiska potentialen, klargöra det direkta kontra indirekta terapeutiska svaret och förutsäga och övervaka det terapeutiska svaret från både stamcells- och immuncellsbaserade terapier.

Olika avbildningsmodaliteter för celltrafik har undersökts 3,4,9,10,12, inklusive optisk avbildning^, magnetisk resonanstomografi (MRI), single-photon emission computed tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET). Var och en av dessa tekniker har sina egna fördelar och nackdelar. Bland dessa är PET den mest lovande modaliteten på grund av dess kvantitativa natur och höga känslighet, vilket är avgörande för tillförlitlig kvantifiering av celler i avbildningsbaserad celltrafik 3,4,9,10.

Den positronemitterande radioisotopen ⁸⁹Zr, med en halveringstid på 78,4 timmar, är lämplig för cellmärkning. Det möjliggör PET-avbildning av celltrafik i över 1 vecka och produceras lätt av allmänt tillgängliga, lågenergimedicinska cyklotroner 13,14,15,16,17. Dessutom är en lämpligt funktionaliserad, p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin (DFO-Bn-NCS) kelator kommersiellt tillgänglig för syntes av en 89 Zr-märkt, färdig att använda, cellmärkningssynton, [89 Zr]Zr-p-isotiocyanatobensyl-desferrioxamin, även känd som [⁸⁹Zr]Zr-DBN 18,19,20,21,22,23,24^,25. Principen för [89 Zr]Zr-DBN-medierad cellmärkning är baserad på en reaktion mellan primära aminer av cellmembranproteiner och isotiocyanatdelen (NCS) av [⁸⁹Zr]Zr-DBN för att producera en stabil kovalent tioureabindning.

[⁸⁹Zr] Zr-DBN-baserad cellmärkning och avbildning har publicerats för att spåra en mängd olika celler, inklusive stamceller 18,23,25, dendritiska celler¹⁸, kardiopoetiska stamceller¹⁹, deciduala stromaceller 20, benmärgshärledda makrofager²⁰, mononukleära celler i perifert blod 20, Jurkat/CAR T-celler^21, hepatocyter 22,24 och vita blodkroppar ²⁵. Följande protokoll tillhandahåller steg-för-steg-metoder för beredning och radiomärkning av celler med [⁸⁹Zr]Zr-DBN och beskriver ändringar som kan krävas i radiomärkningsprotokollet för en specifik celltyp. För tydlighetens skull är den metod för radiomärkning av celler som presenteras här uppdelad i fyra avsnitt. Det första avsnittet handlar om framställningen av [89 Zr]Zr-DBN genom kelatering ^{av 89}Zr med DFO-Bn-NCS. I det andra avsnittet beskrivs beredningen av en biokompatibel formulering av [⁸⁹Zr]Zr-DBN som lätt kan användas för radiomärkning av celler. I det tredje avsnittet behandlas de steg som behövs för att förkonditionera celler för radioaktiv märkning. Förkonditioneringen av celler innebär att cellerna tvättas med proteinfri fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och HEPES-buffrad Hanks-balanserad saltlösning (H-HBSS) för att avlägsna externa proteiner, som kan störa eller konkurrera med reaktionen av [⁸⁹Zr]Zr-DBN med primära aminer som finns på cellytans proteiner under radiomärkning. Det sista avsnittet innehåller steg som är involverade i själva radiomärkningen av cellerna och kvalitetskontrollanalysen.

Protocol

Dendritiska celler och melanomceller erhölls kommersiellt18. Hepatocyter isolerades från levern hos svin efter laparoskopisk partiell hepatektomi22,24. Stamceller isolerades från benmärgsaspirat18,19,26. De fettvävnadshärledda stamcellerna erhölls från Human Cellular Therapy Laboratory, Mayo Clinic Rochester23. Huma…

Representative Results

De representativa resultaten som presenteras i detta manuskript har sammanställts från de tidigare [89Zr]Zr-DBN-syntes- och cellradiomärkningsstudierna 18,19,22,23,24,25. I korthet kan 89Zr framgångsrikt komplexeras med DFO-Bn-NCS på ~30-60 minuter vid 25-37 °C med 7,5-15 μg DFO-Bn-NCS (ta…

Discussion

Följande är kritiska steg i protokollet som behöver optimeras för effektiv cellradiomärkning. I protokollsteg 1.2 och 1.3 måste en lämplig volym (mikroliter) bas, beroende på volymen av [89 Zr]Zr(HPO 4)₂ eller [⁸⁹Zr]ZrCl₄ användas. 1,0 M K 2 CO3 lösning måste användas för neutralisering av [89 Zr] Zr(HPO 4)2 och 1,0 M Na ₂ CO₃ lösning för neutralisering av [⁸⁹Zr] ZrCl₄ för at…

Materials

Acetonitrile	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A996-4
Alpha Minimum Essential Medium	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	12571063
Anion exchange column	Macherey-Nagel, Inc., Düren, Germany	731876	Chromafix 30-PS-HCO3 SPE 45 mg cartridge
Conical centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc., Glendale, AZ, USA	352096	Falcon 15 mL high-clarity polypropylene (PP) conical centrifuge tubes
Dendritic cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-11904
DFO-Bn-NCS	Macrocyclics, Inc., Plano, TX, USA	B-705	p-SCN-Bn-Deferoxamine
DMSO	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	276855
Dose calibrator	Mirion Technologies (Capintec), Inc., Florham Park, NJ, USA	5130-3234	CRC -55tR Dose Calibrator
Dulbecco’s modified Eagle’s medium	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2002
Fetal Bovine Serum (FBS)	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	30-2020
Hanks Balanced Salt solution (HBSS)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	14025092	For preparation of H-HBSS
Hydrochloric Acid (trace metal basis grade)	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	A508P212
Melanoma cells	The American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	CRL-6475
Methanol	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	34860
Microcentrifuge tube	Eppendorf, Hamburg, Germany	30108442	Protein LoBind microcentrifuge tube
Murine GM-CSF	R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN USA	415-ML-010
Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	15140-122
Phosphate Buffered Saline without Ca2+ and Mg2+	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA	10010023	For washing cells
Saline	Covidien LLC, Mansfield, MA, USA	1020	0.9% Sterile Saline Solution
Shaker	Eppendorf, Hamburg, Germany	T1317	Thermomixer
Silica gel-rad-TLC paper sheet	Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA	SGI0001	iTLC-SG