JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.

Abstract

Lysosomen kommunizieren häufig mit einer Vielzahl von Biomolekülen, um den Abbau und andere verschiedene zelluläre Funktionen zu erreichen. Lysosomen sind entscheidend für die menschliche Gehirnfunktion, da Neuronen postmitotisch sind und stark auf den Autophagie-Lysosomen-Weg angewiesen sind, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Trotz Fortschritten im Verständnis verschiedener lysosomaler Funktionen ist die Erfassung der hochdynamischen Kommunikation zwischen Lysosomen und anderen zellulären Komponenten technisch schwierig, insbesondere im Hochdurchsatz. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die kürzlich veröffentlichte endogene (knock-in) Lysosomen-Proximity-Markierungsmethode in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen bereitgestellt.

Sowohl lysosomale Membranproteine als auch Proteine, die Lysosomen in einem Umkreis von 10-20 nm umgeben, können in lebenden menschlichen Neuronen sicher identifiziert und genau quantifiziert werden. Jeder Schritt des Protokolls wird detailliert beschrieben, d.h. hiPSC-Neuronenkultur, Proximity-Markierung, Neuronenernte, Fluoreszenzmikroskopie, biotinylierte Proteinanreicherung, Proteinverdauung, LC-MS-Analyse und Datenanalyse. Zusammenfassend bietet diese einzigartige endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode ein robustes Analysewerkzeug mit hohem Durchsatz, um die hochdynamischen lysosomalen Aktivitäten in lebenden menschlichen Neuronen zu untersuchen.

Introduction

Lysosomen sind katabole Organellen, die Makromoleküle über den lysosomalen Autophagieweg1 abbauen. Neben dem Abbau sind Lysosomen an verschiedenen zellulären Funktionen wie Signaltransduktion, Nährstofferkennung und Sekretion beteiligt 2,3,4. Störungen der lysosomalen Funktion wurden mit lysosomalen Speicherstörungen, Krebs, Alterung und Neurodegeneration in Verbindung gebracht 3,5,6,7. Für postmitotische und stark polarisierte Neuronen spielen Lysosomen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen zellulären Homöostase, der Freisetzung von Neurotransmittern und dem Ferntransport entlang der Axone 8,9,10,11. Die Untersuchung von Lysosomen in menschlichen Neuronen war jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Neuronentechnologien haben die Kultur lebender menschlicher Neuronen ermöglicht, die zuvor unzugänglich waren, und die Lücke zwischen Tiermodellen und menschlichen Patienten überbrückt, um das menschliche Gehirn zu untersuchen12,13. Insbesondere integriert die fortschrittliche i3Neuron-Technologie stabil den Neurogenin-2-Transkriptionsfaktor in das iPSC-Genom unter einem Doxycyclin-induzierbaren Promotor, wodurch iPSCs dazu gebracht werden, sich in 2 Wochen in reine kortikale Neuronen zu differenzieren14,15.

Aufgrund der hochdynamischen lysosomalen Aktivität ist die Erfassung lysosomaler Interaktionen mit anderen zellulären Komponenten technisch anspruchsvoll, insbesondere im Hochdurchsatz. Die Proximity-Markierungstechnologie eignet sich gut zur Untersuchung dieser dynamischen Wechselwirkungen, da sie sowohl stabile als auch transiente/schwache Proteininteraktionen mit außergewöhnlicher räumlicher Spezifität erfassen kann16,17. Technisch hergestellte Peroxidase oder Biotinligase können genetisch mit dem Köderprotein verschmolzen werden. Nach der Aktivierung werden hochreaktive Biotinradikale erzeugt, um benachbarte Proteine kovalent zu markieren, die dann durch Streptavidin-beschichtete Beads für die nachgeschaltete Bottom-up-Proteomik über flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattformen (LC-MS) 17,18,19,20,21 angereichert werden können.

Eine endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode wurde kürzlich entwickelt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in i3Neuronen22 zu erfassen. Die technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2) wurde auf den C-Terminus des lysosomal assoziierten Membranproteins 1 (LAMP1) in iPSCs eingeschlagen, die dann in kortikale Neuronen differenziert werden können. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer lysosomaler Marker23. LAMP1 wird auch in späten Endosomen exprimiert, die zu Lysosomen reifen; Diese späten Endosomen-Lysosomen und nicht-degradativen Lysosomen werden in diesem Protokoll alle als Lysosomen bezeichnet. Diese endogene LAMP1-APEX-Sonde, die auf physiologischer Ebene exprimiert wird, kann LAMP1-Fehllokalisations- und Überexpressionsartefakte reduzieren. Hunderte von lysosomalen Membranproteinen und lysosomalen Interaktoren können mit hervorragender räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen identifiziert und quantifiziert werden.

Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit weiteren Verbesserungen der kürzlich veröffentlichten Methode22 beschrieben. Der gesamte Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasst die hiPSC-abgeleitete Neuronenkultur, die Aktivierung der Proximity-Markierung in Neuronen, die Validierung der APEX-Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie, die Bestimmung eines optimalen Verhältnisses von Streptavidin-Perlen zu Eingangsproteinen, die Anreicherung biotinylierter Proteine, die Proteinverdauung auf Perlen, die Entsalzung und Quantifizierung von Peptiden, die LC-MS-Analyse und die Analyse von Proteomik-Daten. Richtlinien zur Fehlerbehebung und experimentelle Optimierungen werden ebenfalls diskutiert, um die Qualitätskontrolle und Leistung der Proximity-Kennzeichnung zu verbessern.

Protocol

Alle Verfahren wurden von der Biosicherheits- und Ethikkommission der George Washington University genehmigt. Die Zusammensetzungen der in diesem Protokoll verwendeten Medien und Puffer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die hier verwendeten kommerziellen Produktinformationen finden Sie im Materialverzeichnis. 1. Humane iPSC-abgeleitete Neuronenkultur Humane iPSC-Kultur und LAMP1-APEX-Sondenintegration (7 Tage)Matrigel-Stammlösu…

Representative Results

Diese Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Studie wurde an humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen durchgeführt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in situ in lebenden Neuronen zu erfassen. Zellmorphologien von hiPSCs und hiPSC-abgeleiteten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Abbildung 2A dargestellt. Humane iPSCs wachsen in Kolonien in E8-Medium. Die Differenzierung wird eingeleitet, indem iPSCs in Doxycyclin-haltiges Neuroneninduktionsmedium plattiert werden. Ne…

Discussion

Mit dieser LAMP1-APEX-Sonde werden Proteine auf und in der Nähe der lysosomalen Membran biotinyliert und angereichert. Angesichts des typischen Lysosomendurchmessers von 100-1.200 nm bietet diese Methode eine hervorragende intrazelluläre Auflösung mit einem Markierungsradius von 10-20 nm. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer Marker für Lysosomen, der als hervorragendes Köderprotein für die lysosomale APEX-Markierung auf endogener Expressionsebene dient. Einschränkungen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wird durch den NIH-Zuschuss (R01NS121608) unterstützt. A.M.F. dankt dem ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship und dem Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Wir danken dem Michael Ward Labor am National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) für die molekularbiologische Unterstützung und die Entwicklung der i3Neuron-Technologie.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

Proximity Labeling ProteomicsLysosomal MicroenvironmentIPSC-derived NeuronsLysosomal DysfunctionBrain DiseasesBiotin PhenolHydrogen PeroxideAcetone PrecipitationProtein PelletDCA Assay
check_url/64132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image