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Neuroscience

Caracterização do Interactome do Lisossomo Neuronal com Proteômica de Marcação de Proximidade

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

Um protocolo proteômico de marcação de proximidade de lisossomos neuronais é descrito aqui para caracterizar o microambiente lisossômico dinâmico em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos. Proteínas de membrana lisossômica e proteínas que interagem com lisossomos (estável ou transitoriamente) podem ser quantificadas com precisão neste método com excelente resolução espacial intracelular em neurônios humanos vivos.

Abstract

Os lisossomos frequentemente se comunicam com uma variedade de biomoléculas para alcançar a degradação e outras funções celulares diversas. Os lisossomos são críticos para a função cerebral humana, pois os neurônios são pós-mitóticos e dependem fortemente da via autofagia-lisossomo para manter a homeostase celular. Apesar dos avanços na compreensão de várias funções lisossômicas, capturar as comunicações altamente dinâmicas entre lisossomos e outros componentes celulares é tecnicamente desafiador, particularmente de uma forma de alto rendimento. Aqui, um protocolo detalhado é fornecido para o método proteômico de marcação de proximidade de lisossomos endógenos (knock-in) recentemente publicado em neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC).

Tanto as proteínas da membrana lisossômica quanto as proteínas que envolvem os lisossomos dentro de um raio de 10-20 nm podem ser identificadas com confiança e quantificadas com precisão em neurônios humanos vivos. Cada etapa do protocolo é descrita em detalhes, ou seja, cultura de neurônios hiPSC, marcação de proximidade, colheita de neurônios, microscopia de fluorescência, enriquecimento de proteínas biotiniladas, digestão de proteínas, análise de LC-MS e análise de dados. Em resumo, este método único de proteômica de marcação de proximidade lisossômica endógena fornece uma ferramenta analítica robusta e de alto rendimento para estudar as atividades lisossômicas altamente dinâmicas em neurônios humanos vivos.

Introduction

Os lisossomos são organelas catabólicas que degradam macromoléculas através da via lisossômica-autofagia1. Além da degradação, os lisossomos estão envolvidos em diversas funções celulares, como transdução de sinalização, detecção de nutrientes e secreção 2,3,4. Perturbações na função lisossômica têm sido implicadas em distúrbios de armazenamento lisossômico, câncer, envelhecimento e neurodegeneração 3,5,6,7. Para neurônios pós-mitóticos e altamente polarizados, os lisossomos desempenham papéis críticos na homeostase celular neuronal, liberação de neurotransmissores e transporte de longa distância ao longo dos axônios 8,9,10,11. No entanto, investigar lisossomos em neurônios humanos tem sido uma tarefa desafiadora. Avanços recentes nas tecnologias de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) permitiram a cultura de neurônios humanos vivos que antes eram inacessíveis, preenchendo a lacuna entre modelos animais e pacientes humanos para estudar o cérebro humano12,13. Particularmente, a avançada tecnologiai3Neuron integra de forma estável o fator de transcrição da neurogenina-2 no genoma da iPSC sob um promotor induzível por doxiciclina, levando as iPSCs a se diferenciarem em neurônios corticais puros em 2 semanas14,15.

Devido à atividade lisossômica altamente dinâmica, capturar interações lisossômicas com outros componentes celulares é tecnicamente desafiador, particularmente de forma de alto rendimento. A tecnologia de marcação de proximidade é adequada para estudar essas interações dinâmicas devido à sua capacidade de capturar interações proteicas estáveis e transitórias/fracas com excepcional especificidade espacial16,17. A peroxidase modificada ou a biotina ligase podem ser geneticamente fundidas à proteína da isca. Após a ativação, radicais de biotina altamente reativos são produzidos para rotular covalentemente proteínas vizinhas, que podem então ser enriquecidas por esferas revestidas com estreptavidina para proteômica descendente de baixo para cima via cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) plataformas 17,18,19,20,21.

Um método proteômico de marcação de proximidade lisossômica endógena foi recentemente desenvolvido para capturar o microambiente lisossômico dinâmico em i3neurônios22. A ascorbato peroxidase modificada (APEX2) foi batida no terminal C da proteína de membrana associada lisossômica 1 (LAMP1) em iPSCs, que podem então ser diferenciadas em neurônios corticais. A LAMP1 é uma proteína abundante da membrana lisossômica e um marcador lisossômico clássico23. A LAMP1 também é expressa em endossomos tardios, que amadurecem em lisossomos; esses lisossomos endossomáticos tardios e lisossomos não degradativos são todos referidos como lisossomos neste protocolo. Esta sonda endógena LAMP1-APEX, expressa a nível fisiológico, pode reduzir a deslocalização da LAMP1 e os artefactos de sobreexpressão. Centenas de proteínas da membrana lisossômica e interatores lisossômicos podem ser identificados e quantificados com excelente resolução espacial em neurônios humanos vivos.

Aqui, um protocolo detalhado para proteômica de marcação de proximidade de lisossomos em neurônios humanos derivados de iPSC é descrito com melhorias adicionais do método recentemente publicado22. O fluxo de trabalho geral é ilustrado na Figura 1. O protocolo inclui cultura de neurônios derivados de hiPSC, ativação de marcação de proximidade em neurônios, validação da atividade do APEX por microscopia de fluorescência, determinação de uma ótima relação entre contas de estreptavidina e proteína de entrada, enriquecimento de proteínas biotiniladas, digestão de proteínas em contas, dessalinização e quantificação de peptídeos, análise de LC-MS e análise de dados proteômicos. Diretrizes de solução de problemas e otimizações experimentais também são discutidas para melhorar o controle de qualidade e o desempenho da rotulagem de proximidade.

Protocol

Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê de biossegurança e ética da Universidade George Washington. As composições de meios e buffers utilizados neste protocolo estão apresentadas na Tabela 1. As informações comerciais do produto usadas aqui são fornecidas na Tabela de Materiais. 1. Cultura de neurônios derivados de iPSC humana Cultura de iPSC humana e integração da sonda LAMP1-APEX (7 dias)Descongelar …

Representative Results

Este estudo proteômico de marcação de proximidade de lisossomos foi conduzido em neurônios humanos derivados de iPSC para capturar o microambiente lisossômico dinâmico in situ em neurônios vivos. As morfologias celulares de hiPSCs e neurônios derivados de hiPSC em diferentes momentos são ilustradas na Figura 2A. As iPSCs humanas crescem em colônias em meio E8. A diferenciação é iniciada pelo revestimento de iPSCs em meio de indução de neurônios contendo doxiciclina. …

Discussion

Usando esta sonda LAMP1-APEX, as proteínas sobre e perto da membrana lisossômica são biotiniladas e enriquecidas. Dado o diâmetro típico do lisossomo de 100-1.200 nm, este método fornece excelente resolução intracelular com um raio de marcação de 10-20 nm. A LAMP1 é uma proteína de membrana lisossômica abundante e um marcador clássico para lisossomos, servindo como uma excelente proteína isca para a marcação de APEX lisossômico no nível de expressão endógena. No entanto, também existem limitações …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo é apoiado pela bolsa do NIH (R01NS121608). A A.M.F. reconhece a ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship e a Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Agradecemos ao laboratório Michael Ward do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS) pelo apoio à biologia molecular e pelo desenvolvimento da tecnologia i3Neuron.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
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Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
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