JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Published: June 23, 2022
doi:
10.3791/64132
, ,
1Department of Chemistry,The George Washington University

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Abstract

Lizozomlar, bozunmayı ve diğer çeşitli hücresel fonksiyonları elde etmek için sıklıkla çeşitli biyomoleküllerle iletişim kurar. Lizozomlar insan beyni fonksiyonu için kritik öneme sahiptir, çünkü nöronlar postmitotiktir ve hücresel homeostazı korumak için otofaji-lizozom yoluna büyük ölçüde güvenirler. Çeşitli lizozomal fonksiyonların anlaşılmasındaki ilerlemelere rağmen, lizozomlar ve diğer hücresel bileşenler arasındaki son derece dinamik iletişimi yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) kaynaklı nöronlarda proteomik yöntemi etiketleyen yakın zamanda yayınlanan endojen (knock-in) lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır.

Hem lizozomal membran proteinleri hem de 10-20 nm yarıçap içindeki lizozomları çevreleyen proteinler, canlı insan nöronlarında güvenle tanımlanabilir ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Protokolün her adımı, yani hiPSC-nöron kültürü, yakınlık etiketleme, nöron hasadı, floresan mikroskopisi, biyotinile protein zenginleştirme, protein sindirimi, LC-MS analizi ve veri analizi gibi ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Özetle, bu eşsiz endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi, canlı insan nöronlarındaki son derece dinamik lizozomal aktiviteleri incelemek için yüksek verimli ve sağlam bir analitik araç sağlar.

Introduction

Lizozomlar, makromolekülleri lizozomal-otofaji yolu1 yoluyla parçalayan katabolik organellerdir. Bozunmanın yanı sıra, lizozomlar sinyal iletimi, besin algılaması ve sekresyon 2,3,4 gibi çeşitli hücresel fonksiyonlarda rol oynar. Lizozomal fonksiyondaki pertürbasyonlar lizozomal depo bozuklukları, kanser, yaşlanma ve nörodejenerasyon 3,5,6,7 ile ilişkilendirilmiştir. Postmitotik ve yüksek polarize nöronlar için, lizozomlar nöronal hücresel homeostaz, nörotransmitter salınımı ve aksonlarboyunca uzun mesafeli transportta kritik rol oynar 8,9,10,11. Bununla birlikte, insan nöronlarındaki lizozomları araştırmak zor bir görev olmuştur. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı nöron teknolojilerindeki son gelişmeler, daha önce erişilemeyen canlı insan nöronlarının kültürünü mümkün kılarak hayvan modelleri ile insan hastaları arasındaki boşluğu doldurarak insan beynini incelemiştir12,13. Özellikle, gelişmiş i3Nöron teknolojisi, nörogenin-2 transkripsiyon faktörünü doksisiklin ile indüklenebilir bir promotör altında iPSC genomuna istikrarlı bir şekilde entegre eder ve iPSC’leri 2 hafta içinde saf kortikal nöronlara farklılaşmaya yönlendirir14,15.

Son derece dinamik lizozomal aktivite nedeniyle, diğer hücresel bileşenlerle lizozomal etkileşimleri yakalamak, özellikle yüksek verimli bir şekilde, teknik olarak zordur. Yakınlık etiketleme teknolojisi, olağanüstü mekansal özgüllük16,17 ile hem kararlı hem de geçici / zayıf protein etkileşimlerini yakalama kabiliyeti nedeniyle bu dinamik etkileşimleri incelemek için çok uygundur. Mühendislik peroksidaz veya biyotin ligaz, genetik olarak yem proteinine kaynaştırılabilir. Aktivasyon üzerine, komşu proteinleri kovalent olarak etiketlemek için oldukça reaktif biyotin radikalleri üretilir, bunlar daha sonra sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) platformları17,18,19,20,21 aracılığıyla aşağı akış aşağıdan yukarıya proteomikler için streptavidin kaplı boncuklarla zenginleştirilebilir.

Yakın zamanda i3Nöronlar22’deki dinamik lizozomal mikro ortamı yakalamak için endojen lizozomal yakınlık etiketleme proteomik yöntemi geliştirilmiştir. Mühendislik askorbat peroksidaz (APEX2), iPSC’lerde lizozomal ilişkili membran proteini 1’in (LAMP1) C-terminusuna çarptı ve daha sonra kortikal nöronlara farklılaştırıldı. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve klasik bir lizozomal belirteç23’tür. LAMP1 ayrıca lizozomlara olgunlaşan geç endozomlarda da ifade edilir; Bu geç endozozom-lizozomlar ve degradatif olmayan lizozomların hepsi bu protokolde lizozomlar olarak adlandırılır. Fizyolojik düzeyde eksprese edilen bu endojen LAMP1-APEX probu, LAMP1 yanlış lokalizasyonunu ve aşırı ekspresyon artefaktlarını azaltabilir. Yüzlerce lizozomal membran proteini ve lizozomal interaktör, canlı insan nöronlarında mükemmel uzamsal çözünürlükle tanımlanabilir ve ölçülebilir.

Burada, insan iPSC türevi nöronlarında proteomikleri etiketleyen lizozom yakınlığı için ayrıntılı bir protokol, yakın zamanda yayınlanan yöntem22’den daha fazla iyileştirme ile açıklanmaktadır. Genel iş akışı Şekil 1’de gösterilmiştir. Protokol, hiPSC kaynaklı nöron kültürünü, nöronlarda yakınlık etiketleme aktivasyonunu, floresan mikroskobu ile APEX aktivitesinin doğrulanmasını, optimal streptavidin boncuk-giriş protein oranının belirlenmesini, biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesini, boncuk üzerinde protein sindirimini, peptid tuzunu alma ve nicelleştirmeyi, LC-MS analizini ve proteomik veri analizini içerir. Yakınlık etiketleme kalite kontrolünü ve performansını iyileştirmek için sorun giderme yönergeleri ve deneysel optimizasyonlar da tartışılmaktadır.

Protocol

Tüm prosedürler George Washington Üniversitesi biyogüvenlik ve etik komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan ortam ve tampon bileşimleri Tablo 1’de verilmiştir. Burada kullanılan ticari ürün bilgileri Malzeme Tablosunda verilmiştir. 1. İnsan iPSC kaynaklı nöron kültürü İnsan iPSC kültürü ve LAMP1-APEX prob entegrasyonu (7 gün)Matrigel stok çözeltisini gece boyunca 4 ° C’de bir b…

Representative Results

Bu lizozom yakınlık etiketleme proteomik çalışması, canlı nöronlarda dinamik lizozomal mikro ortamı in situ olarak yakalamak için insan iPSC türevi nöronlarında gerçekleştirildi. Farklı zaman noktalarındaki hiPSC’lerin ve hiPSC türevi nöronların hücre morfolojileri Şekil 2A’da gösterilmiştir. İnsan iPSC’leri E8 ortamındaki kolonilerde büyür. Farklılaşma, iPSC’lerin doksisiklin içeren nöron indüksiyon ortamına kaplanmasıyla başlatılır. Nörit uza…

Discussion

Bu LAMP1-APEX probu kullanarak, lizozomal membran üzerindeki ve yakınındaki proteinler biyotinile edilir ve zenginleştirilir. 100-1.200 nm’lik tipik lizozom çapı göz önüne alındığında, bu yöntem 10-20 nm etiketleme yarıçapı ile mükemmel hücre içi çözünürlük sağlar. LAMP1, bol miktarda lizozomal membran proteini ve lizozomlar için klasik bir belirteçtir ve endojen ekspresyon seviyesinde lizozomal APEX etiketlemesi için mükemmel bir yem proteini görevi görür. Bununla birlikte, lizozomları …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma NIH hibesi (R01NS121608) tarafından desteklenmektedir. A.M.F., ARCS-Metro Washington Bölüm Bursu ve Bourbon F. Scribner Bağış Bursu’nu kabul eder. Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü’ndeki (NINDS) Michael Ward laboratuvarına moleküler biyoloji desteği ve i3Nöron teknolojisi gelişimi için teşekkür ederiz.

Materials

10% (w/v) Saponin solution Acros Organics 419231000 Flourescent Microscopy
Accutase Life Technologies A1110501 cell detachment solution, Cell Culture
B27 Supplement Fisher Scientific 17504044 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
BDNF PeproTech 450-02 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Boric acid Sigma-Aldrich B6768 Cell Culture, Borate Buffer
Bovine Serum Albumin Millipore Sigma A8806 To make standard solutions to measure total protein concentrations
Brainphys neuronal medium STEMCELL Technologies 5790 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 Thermo Fisher Scientific 505-0452-82 Flourescent Microscopy
Chroman1 ROCK inhibitor Tocris 716310 Cell Culture
cOmplete mini Protease Inhibitor Roche 4693123001 cocktail inhibitor in Lysis Buffer
DC Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000112 To determine total protein concentrations of cell lysate
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Proximity-labeling Reaction
DMEM/F12 medium Thermo Fisher Scientific 11320082 Cell Culture, Dish Coating
DMEM/F12 medium with HEPES Thermo Fisher Scientific 11330057 Cell Culture, Induction Medium
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663 Flourescent Microscopy
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) Sigma-Aldrich D9891-1G Cell Culture, Induction Medium
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 Cell Culture
Essential 8 Supplement (50x) Thermo Fisher Scientific A1517101 Cell Culture
Extraction plate vacuum manifold kit Waters WAT097944 For Peptide desalting
Formic Acid (FA) Fisher Scientific A11750 For LC-MS analysis
GDNF PeproTech 450-10 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Hoechst dye Thermo Fisher Scientific 62239 Flourescent Microscopy
HPLC grade methanol Fisher Scientific A452 For Peptide desalting
HPLC grade water Fisher Scientific W5 For Peptide desalting
Human induced pluripotent stem cells Corriell Institute GM25256 Cell Culture
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. Thermo Fisher Scientific AA33323AD Proximity-labeling Reaction
Iodoacetamide (IAA) Millipore Sigma I6125 For Protein Digestion
Laminin Fisher Scientific 23017015 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
LC-MS grade Acetonitrile Fisher Scientific A955 For LC-MS analysis
LC-MS grade water Fisher Scientific W64 For LC-MS analysis
L-glutamine Fisher Scientific 25-030-081 Cell Culture, Induction Medium
Matrigel Thermo Fisher Scientific 08-774-552 basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody Developmental Studies Hybridoma Bank h4a3 Flourescent Microscopy
N-2 Supplement (100x) Fisher Scientific 17-502-048 Cell Culture, Induction Medium
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm Bio-Rad 1620145 To conduct dot blot assay for bead titration
Non-essential amino acids (NEAA) Fisher Scientific 11-140-050 Cell Culture, Induction Medium
NT-3 PeproTech 450-03 Cell Culture, Cortical Neuron Medium
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate Waters 186000309 For Peptide desalting
Odyssey Blocking Buffer (TBS) LI-COR Biosciences 927-50000 To conduct dot blot assay for bead titration
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Flourescent Microscopy
Phenol Biotin (1,000x stock) Adipogen 41994-02-9 Proximity-labeling Reaction
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium Gibco 10010049 Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay Thermo Fisher 23275 Peptide Concentration Assay
Poly-L-Ornithine (PLO) Millipore Sigma P3655 Cell Culture, Dish Coating
Sodium Ascorbate Sigma-Aldrich A4034 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy
Sodium chloride Thermo Fisher Scientific S271500 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Thermo Fisher Scientific BP1311220 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 415413 Cell Culture, Borate Buffer
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich 221732 Cell Culture, Borate Buffer
SpeedVac concentrator vacuum concentrator
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads Cytiva (formal GE) 28-9857-99 Enrich biotinylated proteins
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate Thermo Fisher Scientific S32358 To conduct dot blot assay for bead titration
Thermomixer temperature-controlled mixer
Trifluoacetic acid (TFA) Millipore Sigma 302031 For Peptide desalting
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Millipore Sigma C4706 For Protein Digestion
Tris-HCl Thermo Fisher Scientific BP152500 Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer
Triton-X Thermo Fisher Scientific BP151500 Beads wash buffer
TROLOX Sigma-Aldrich 648471 Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade Promega V5073 For Protein Digestion
TWEEN 20 Millipore Sigma P1379 Dot blot assay buffer
Urea Thermo Fisher Scientific BP169500 Beads wash and On-Beads Digestion Buffer
Vitronectin STEMCELL Technologies 7180 Cell Culture, Dish Coating
Y-27632 ROCK inhibitor Selleck S1049 Cell Culture
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
  2. Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
  3. Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
  4. Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
  5. Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
  6. Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
  7. Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
  8. Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
  9. Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
  10. Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
  11. Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
  12. Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
  13. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  14. Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
  15. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
  16. Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
  17. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  18. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  19. Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
  20. Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
  21. Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
  22. Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
  23. Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
  24. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  25. Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
  26. Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
  27. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  28. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  29. Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
  30. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
  31. Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
  32. Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
  33. kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
  34. Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
  35. Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
  36. Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
  37. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  38. Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
  39. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  40. Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
  41. Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
  42. Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  43. Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
  44. Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).

Tags

Proximity Labeling ProteomicsLysosomal MicroenvironmentIPSC-derived NeuronsLysosomal DysfunctionBrain DiseasesBiotin PhenolHydrogen PeroxideAcetone PrecipitationProtein PelletDCA Assay
check_url/64132?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Frankenfield, A., Ni, J., Hao, L. Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics. J. Vis. Exp. (184), e64132, doi:10.3791/64132 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image