En neuronal lysosomnærhed mærkning proteomics protokol er beskrevet her for at karakterisere det dynamiske lysosomale mikromiljø i humant inducerede pluripotente stamcelleafledte neuroner. Lysosomale membranproteiner og proteiner, der interagerer med lysosomer (stabilt eller forbigående), kan nøjagtigt kvantificeres i denne metode med fremragende intracellulær rumlig opløsning i levende humane neuroner.
Lysosomer kommunikerer ofte med en række biomolekyler for at opnå nedbrydning og andre forskellige cellulære funktioner. Lysosomer er kritiske for menneskets hjernefunktion, da neuroner er postmitotiske og er stærkt afhængige af autofagi-lysosomvejen for at opretholde cellulær homeostase. På trods af fremskridt i forståelsen af forskellige lysosomale funktioner er det teknisk udfordrende at fange den meget dynamiske kommunikation mellem lysosomer og andre cellulære komponenter, især på en måde med høj kapacitet. Her leveres en detaljeret protokol for den nyligt offentliggjorte endogene (knock-in) lysosomnærhedsmærkning proteomiske metode i humaninducerede pluripotente stamcelle (hiPSC) -afledte neuroner.
Både lysosomale membranproteiner og proteiner, der omgiver lysosomer inden for en radius på 10-20 nm, kan med sikkerhed identificeres og kvantificeres nøjagtigt i levende humane neuroner. Hvert trin i protokollen er beskrevet detaljeret, dvs. hiPSC-neuronkultur, nærhedsmærkning, neuronhøst, fluorescensmikroskopi, biotinyleret proteinberigelse, proteinfordøjelse, LC-MS-analyse og dataanalyse. Sammenfattende giver denne unikke endogene lysosomale nærhedsmærkningsproteomics-metode et højt gennemstrømnings- og robust analytisk værktøj til at studere de meget dynamiske lysosomale aktiviteter i levende menneskelige neuroner.
Lysosomer er kataboliske organeller, der nedbryder makromolekyler via lysosomal-autofagivejen1. Udover nedbrydning er lysosomer involveret i forskellige cellulære funktioner såsom signaltransduktion, næringsstofføling og sekretion 2,3,4. Forstyrrelser i lysosomal funktion har været impliceret i lysosomale opbevaringsforstyrrelser, kræft, aldring og neurodegeneration 3,5,6,7. For postmitotiske og stærkt polariserede neuroner spiller lysosomer kritiske roller i neuronal cellulær homeostase, frigivelse af neurotransmitter og langdistancetransport langs axonerne 8,9,10,11. Imidlertid har undersøgelse af lysosomer i humane neuroner været en udfordrende opgave. Nylige fremskridt inden for inducerede pluripotente stamcelle (iPSC) -afledte neuronteknologier har gjort det muligt for kulturen af levende menneskelige neuroner, der tidligere var utilgængelige, og bygger bro over kløften mellem dyremodeller og menneskelige patienter til at studere den menneskelige hjerne12,13. Især integrerer den avancerede i3Neuron-teknologi stabilt neurogenin-2-transkriptionsfaktoren i iPSC-genomet under en doxycyclin-inducerbar promotor, hvilket får iPSC’er til at differentiere sig til rene kortikale neuroner i 2 uger14,15.
På grund af den meget dynamiske lysosomale aktivitet er det teknisk udfordrende at fange lysosomale interaktioner med andre cellulære komponenter, især på en måde med høj kapacitet. Nærhedsmærkningsteknologi er velegnet til at studere disse dynamiske interaktioner på grund af dens evne til at fange både stabile og forbigående / svage proteininteraktioner med enestående rumlig specificitet16,17. Konstrueret peroxidase eller biotin ligase kan genetisk smeltes sammen med agnproteinet. Ved aktivering produceres stærkt reaktive biotinradikaler for kovalent at mærke naboproteiner, som derefter kan beriges med streptavidinbelagte perler til nedstrøms bottom-up proteomics via væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) platforme 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal nærhedsmærkning proteomics metode blev for nylig udviklet til at fange det dynamiske lysosomale mikromiljø ii 3neuroner22. Konstrueret ascorbatperoxidase (APEX2) blev banket ind på C-terminalen af det lysosomale associerede membranprotein 1 (LAMP1) i iPSC’er, som derefter kan differentieres til kortikale neuroner. LAMP1 er et rigeligt lysosomalt membranprotein og en klassisk lysosomal markør23. LAMP1 udtrykkes også i sene endosomer, som modnes til lysosomer; Disse sene endosom-lysosomer og ikke-nedbrydende lysosomer omtales alle som lysosomer i denne protokol. Denne endogene LAMP1-APEX-sonde, udtrykt på det fysiologiske niveau, kan reducere LAMP1-fejllokalisering og overudtryksartefakter. Hundredvis af lysosomale membranproteiner og lysosomale interactors kan identificeres og kvantificeres med fremragende rumlig opløsning i levende menneskelige neuroner.
Her beskrives en detaljeret protokol for lysosomnærhedsmærkning af proteomics i humane iPSC-afledte neuroner med yderligere forbedringer fra den nyligt offentliggjorte metode22. Den overordnede arbejdsgang er illustreret i figur 1. Protokollen inkluderer hiPSC-afledt neuronkultur, nærhedsmærkningsaktivering i neuroner, validering af APEX-aktivitet ved fluorescensmikroskopi, bestemmelse af et optimalt streptavidin-perle-til-input-proteinforhold, berigelse af biotinylerede proteiner, proteinfordøjelse på perler, peptidafsaltning og kvantificering, LC-MS-analyse og proteomics-dataanalyse. Retningslinjer for fejlfinding og eksperimentelle optimeringer diskuteres også for at forbedre kvalitetskontrol og ydeevne for nærhedsmærkning.
Ved hjælp af denne LAMP1-APEX-sonde biotinyleres proteiner på og nær lysosomalmembranen og beriges. I betragtning af den typiske lysosomdiameter på 100-1.200 nm giver denne metode fremragende intracellulær opløsning med en mærkningsradius på 10-20 nm. LAMP1 er et rigeligt lysosomalt membranprotein og en klassisk markør for lysosomer, der tjener som et fremragende agnprotein til lysosomal APEX-mærkning på det endogene ekspressionsniveau. Der findes dog også begrænsninger, når man bruger LAMP1 til at målrett…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse understøttes af NIH-bevillingen (R01NS121608). A.M.F. anerkender ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship og Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi takker Michael Ward-laboratoriet ved National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) for molekylærbiologisk støtte og i3Neuron-teknologiudviklingen.
10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |