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Biology

सुसंस्कृत मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव, लक्षण वर्णन और चिकित्सीय अनुप्रयोग

Published: September 23, 2022 doi: 10.3791/64135
Automatic Translation
1,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,5, 2, 2, 2,3
1College of Life Science, Northwest University, 2State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, School of Stomatology, Fourth Military Medical University, 3Xi'an Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, 4School of Basic Medicine, Fourth Military Medical University, 5Department of Orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल सुसंस्कृत मानव एमएससी से प्रतिनिधि ईवी (एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स) को अलग करने और चिह्नित करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का वर्णन करता है। इन ईवी के आगे के अनुप्रयोगों को भी इस लेख में समझाया गया है।

Abstract

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवी) अधिकांश सेल प्रकारों द्वारा जारी विषम झिल्ली नैनोकणों हैं, और उन्हें जीव होमियोस्टैसिस के शारीरिक नियामकों और विकृति के महत्वपूर्ण संकेतकों के रूप में तेजी से पहचाना जाता है; इस बीच, सुलभ और नियंत्रणीय रोग चिकित्सा स्थापित करने की उनकी अपार क्षमता उभर रही है। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) संस्कृति में बड़ी मात्रा में ईवी जारी कर सकते हैं, जिन्होंने प्रभावी ऊतक पुनर्जनन शुरू करने और अच्छी स्केलेबिलिटी और प्रजनन क्षमता के साथ व्यापक चिकित्सीय अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करने का वादा दिखाया है। एमएससी-ईवी एकत्र करने और लागू करने के लिए सरल और प्रभावी प्रोटोकॉल की बढ़ती मांग है। यहां, आगे के अनुप्रयोगों के लिए सुसंस्कृत मानव एमएससी, एक्सोसोम और माइक्रोवेसिकल्स से प्रतिनिधि ईवी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के आधार पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। इस विधि की अनुकूलनशीलता डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला के लिए दिखाई गई है, जैसे लेबलिंग, स्थानीय प्रत्यारोपण और प्रणालीगत इंजेक्शन। इस प्रक्रिया के कार्यान्वयन से ट्रांसलेशनल अनुसंधान में सरल और विश्वसनीय एमएससी-ईवी संग्रह और आवेदन की आवश्यकता को संबोधित किया जाएगा।

Introduction

स्टेम सेल स्व-नवीकरण क्षमता और ट्रांसलेशनल क्षमताके साथ उदासीन प्लुरिपोटेंट कोशिकाएं हैं। मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एमएससी) प्रयोगशाला में आसानी से अलग, सुसंस्कृत, विस्तारित और शुद्ध होते हैं, जो कई मार्गों के बाद स्टेम कोशिकाओं की विशेषता बनी रहती है। हाल के वर्षों में, बढ़ते सबूतों ने इस दृष्टिकोण का समर्थन किया है कि एमएससी चिकित्सीय उपयोग 2,3 में पैराक्रिन मोड में कार्य करते हैं। विशेष रूप से बाह्य पुटिकाओं (ईवी) का स्राव एमएससी के जैविक कार्यों की मध्यस्थता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अधिकांश सेल प्रकारों से जारी विषम झिल्लीदार नैनोकणों के रूप में, ईवी में एक्सोसोम (एक्सोस), माइक्रोवेसिकल्स (एमवी) और यहां तक कि बड़े एपोप्टोटिक बॉडी 4,5 नामक उपश्रेणियां होती हैं। उनमें से, एक्सोस 40-150 एनएम के आकार के साथ सबसे व्यापक रूप से अध्ययन किया गया ईवी है, जो एक एंडोसोमल मूल का है और शारीरिक स्थितियों में सक्रिय रूप से स्रावित होता है। एमवी का निर्माण 100-1,000 एनएम के व्यास के साथ सेल प्लाज्मा झिल्ली की सतह से सीधे बहकर किया जाता है, जो फॉस्फेटिडिलसेरिन की उच्च अभिव्यक्ति औरदाता कोशिकाओं के सतह मार्करों की अभिव्यक्ति की विशेषता है। ईवी में आरएनए, प्रोटीन और अन्य बायोएक्टिव अणु होते हैं, जिनके मूल कोशिकाओं के समान कार्य होते हैं और सेल संचार, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ऊतकक्षति की मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एमएससी-ईवी को पुनर्योजी चिकित्सा8 में एक शक्तिशाली सेल-मुक्त चिकित्सीय उपकरण के रूप में व्यापक रूप से जांच की गई है।

एमएससी-व्युत्पन्न ईवी का अलगाव और शुद्धिकरण अनुसंधान और अनुप्रयोग के क्षेत्र में एक आम मुद्दा है। वर्तमान में, अंतर और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन9, अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया 10, इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण11, आणविक बहिष्करण क्रोमैटोग्राफ 12, और माइक्रोफ्लुइडिक चिप13 ईवी के अलगाव और शुद्धिकरण में व्यापक रूप से नियोजित तरीके हैं। प्रत्येक दृष्टिकोण के फायदे और नुकसान के साथ, एकत्र किए गए ईवी की मात्रा, शुद्धता और गतिविधि को एक ही समय मेंसंतुष्ट नहीं किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, सुसंस्कृत एमएससी से ईवी के अलगाव और लक्षण वर्णन के अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन प्रोटोकॉल को विस्तार से दिखाया गया है, जिसने कुशल चिकित्सीय उपयोग 16,17,18,19,20 का समर्थन किया है। फ्लोरोसेंट लेबलिंग, स्थानीय प्रत्यारोपण और प्रणालीगत इंजेक्शन जैसे डाउनस्ट्रीम दृष्टिकोणों की एक श्रृंखला के लिए इस विधि की अनुकूलनशीलता को आगे उदाहरण दिया गया है। इस प्रक्रिया को लागू करने से ट्रांसलेशनल अनुसंधान में एमएससी-ईवी के सरल और विश्वसनीय संग्रह और अनुप्रयोग की आवश्यकता को संबोधित किया जाएगा।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया था। आठ सप्ताह के C57Bl/6 चूहों (महिलाओं या पुरुषों के लिए कोई प्राथमिकता नहीं) का उपयोग किया गया था। क्रायोसंरक्षित मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी (यूसीएमएससी), वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है, एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)। मानव कोशिकाओं के उपयोग को चौथे सैन्य चिकित्सा विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. मानव मेसेनकाइमल स्टेम सेल (एचएमएससी) की संस्कृति

  1. प्रायोगिक कार्य के लिए आवश्यक सामान और समाधान तैयार करें, जिसमें पिपेट, पिपेट टिप्स, 10 सेमी पेट्री डिश, थर्मोस्टैटिक उपकरण (पानी का स्नान), रबर दस्ताने, 75% अल्कोहल, कल्चर माध्यम (37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट), घातक गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 100 एक्स पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) समाधान शामिल हैं ( सामग्री की तालिका देखें)।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अल्फा-न्यूनतम आवश्यक माध्यम (α-एमईएम) को 20% एफबीएस और 1% पी / एस के साथ पूरक करके तैयार करें।
    नोट: अल्ट्राप्योर फ़िल्टर ्ड जल शोधन प्रणाली द्वारा बनाए गए अल्ट्राप्योर फ़िल्टर ्ड पानी में ईवी के अलगाव और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों को पतला करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. क्रायोसंरक्षित मानव गर्भनाल-व्युत्पन्न एमएससी (यूसीएमएससी) को तरल नाइट्रोजन से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पिघलाकर पुनर्प्राप्त करें।
  4. जल्दी और धीरे से पिघले हुए सेल निलंबन को 5 एमएल कल्चर माध्यम (चरण 1.2) के साथ 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज, 5 मिनट के लिए 500 x जी ।
  5. एक बाँझ पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला को हटा दें और सेल अवक्षेप को बनाए रखें। सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें और धीरे से कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  6. कोशिकाओं को 10 सेमी पेट्री डिश में बीज दें, और कुल 10 एमएल में 8 एमएल कल्चर माध्यम जोड़ें।
  7. सेल इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर एमएससी कल्चर करें।

2. एक्सोस और एमवी के अलगाव के लिए विभेदक सेंट्रीफ्यूजेशन।

  1. जब एमएससी >90% संगम तक बढ़ते हैं, तो संस्कृति माध्यम को α-एमईएम के साथ प्रतिस्थापित करें, जो प्रत्येक डिश के 8 एमएल के लिए 20% ईवी-क्षीण एफबीएस और 1% पी / एस के साथ पूरक हो।
    नोट: ईवी और अन्य अशुद्धियों को दूर करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस, 1,50,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज एफबीएस।
  2. संस्कृति के 48 घंटे के बाद, संस्कृति माध्यम (चरण 2.1) को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें।
  3. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 800 एक्स जी पर एमएससी कल्चर माध्यम को सेंट्रीफ्यूज करें।
  4. सतह पर तैरनेवाले को 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों को साफ करने के लिए स्थानांतरित करके सेल के टुकड़े और सेलुलर मलबे को हटा दें।
    नोट: ईवी उपज बढ़ाने के लिए 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों का उपयोग करना आवश्यक है।
  5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 16,000 एक्स जी पर सतह पर तैरनेवाला को सेंट्रीफ्यूज करें। कोशिकाओं के प्रत्येक डिश से एमवी को पीबीएस के 50 μL के साथ फिर से निलंबित कर दिया गया था।
  6. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को साफ करने के लिए पिपेट द्वारा चरण 2.5 में सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा प्राप्त सुपरनैटेंट को स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1,50,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
  7. सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और अवशेषों को इकट्ठा करें, जो एक्सोस है। पीबीएस के 50 μL में कोशिकाओं के सात व्यंजनों से एक्सोस को पुन: निलंबित करें।
    नोट: छठे पारित यूसीएमएससी का उपयोग ईवी अलगाव के लिए किया जाता है। प्रयोगात्मक उपयोग के लिए पर्याप्त एमवी और एक्सोस प्राप्त करने के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं के 7-8 व्यंजनों की आमतौर पर आवश्यकता होती है। ईवी नमूने का उपयोग तुरंत निम्नलिखित लक्षण वर्णन चरणों या चिकित्सीय अनुप्रयोग के लिए किया जाता है, जो बेहतर संग्रहीत नहीं है।
    सावधानी: ईवी के बार-बार ठंड और पिघलने से बचें, और ईवी को अल्पावधि में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना सबसे अच्छा है और -80 डिग्री सेल्सियस पर नहीं।

3. एमएससी से ईवी के कण संख्या और आकार वितरण का पता लगाना

नोट: आकार वितरण मूल्यांकन के लिए, नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषक ( सामग्री की तालिका देखें) द्वारा किया जाता है।

  1. पीबीएस के 1,499 μL में EVs के 1 μL (चरण 2.5 और चरण 2.7 से) पतला करें और 15 mL ट्यूब में पर्याप्त मिलाएं।
  2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए ट्रैकिंग विश्लेषक संचालित करें। सबसे पहले, संगत सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  3. आसुत जल के साथ नमूना सेल भरें, और फिर उपकरण को सेल जांच शुरू करने की अनुमति दें।
  4. उपकरण को एक तैयार मानक समाधान के साथ कैलिब्रेट करें। सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर डिटेक्शन इंटरफ़ेस पर प्रदर्शित कण संख्या 50-400 (अधिमानतः लगभग 200) के बीच है। क्लिक करें OK.
    नोट: प्राथमिक समाधान उत्पन्न करने के लिए 1 मिलीलीटर आसुत जल में अंशांकन समाधान ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 μL का पुनर्गठन करके मानक समाधान तैयार करें, और फिर प्राथमिक समाधान का 100 μL लें और एक मानक समाधान (1: 250,000) तैयार करने के लिए 25 मिलीलीटर आसुत जल जोड़ें। इस काम करने वाले अभिकर्मक को एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. 5 मिलीलीटर आसुत जल के साथ नमूना सेल को कुल्ला करें।
  6. नमूना विश्लेषण से पहले, चैनल को 1 एमएल आसुत जल के साथ फ्लश करें। सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर डिटेक्शन इंटरफ़ेस पर प्रदर्शित कण संख्या 10 से कम है।
  7. चरण 3.1 में तैयार ईवी नमूने के 1 एमएल इंजेक्ट करें। उपकरण के ऑपरेटिंग निर्देशों के अनुसार पुटिका परीक्षण करें।
    सावधानी: नमूना और आसुत जल को सावधानीपूर्वक मैनुअल नियंत्रण के तहत 0.5 एमएल / सेकंड की निरंतर गति से 1 एमएल सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया जाता है।

4. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) द्वारा ईवी आकृति विज्ञान का लक्षण वर्णन

  1. पीबीएस के 199 μL में चरण 2.7 से EVs के 1 μL को पतला करें और पर्याप्त मिलाएं। कार्बन-लेपित वर्ग जाल ( सामग्री की तालिका देखें) में ईवी निलंबन बूंदों के 20 μL जोड़ें, और इसे 3 मिनट तक रहने दें।
  2. एक छोटे फिल्टर पेपर द्वारा अतिरिक्त तरल निकालें, और सतह को थोड़ा सूखने के लिए इसे 15 सेकंड तक रहने दें।
  3. 40 सेकंड के लिए 1.5% फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड बूंदों के साथ ईवी नमूनों को नकारात्मक रूप से दाग दें।
  4. अतिरिक्त फॉस्फोटुंगस्टिक एसिड को हटा दें और इसे सतह को थोड़ा सूखने के लिए 15 सेकंड तक खड़े रहने दें।
  5. कार्बन-लेपित वर्ग जाल युक्त नमूने को फिल्टर पेपर के साथ कवर किए गए एक साफ पकवान में रखें। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ छवियों का निरीक्षण और कैप्चर करें।
    नोट: इस प्रक्रिया में, एक्सोस को एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है।

5. एमएससी-व्युत्पन्न ईवी की लेबलिंग

  1. ईवीएस निष्कर्षण (चरण 2.5) के बाद, 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में पीबीएस के 250 μL के साथ पुन: निलंबित करें।
  2. पीकेएच 26 डाई के कामकाजी समाधान तैयार करने के लिए एक और 1.5 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करें; PKH26 लेबलिंग अभिकर्मक के 1 μL का उपयोग करें जो 250 μL Diluent C (वर्तमान अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ईवी लेबलिंग किट का एक घटक, सामग्री की तालिका देखें) के साथ पतला है।
    नोट: उपयोग करने से तुरंत पहले कार्य समाधान तैयार करें।
    चेतावनी: अत्यधिक पीकेएच 26 डाई या पूर्व-कमजोर पड़ने के बिना लेबलिंग से ईवी को नुकसान पहुंचने का खतरा होता है।
  3. पुन: निलंबित ईवी को कामकाजी समाधान के साथ मिलाएं। इसे 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें, और फिर प्रतिक्रिया को रोकने के लिए ईवी-क्षीण एफबीएस के 500 μL जोड़ें।
  4. एमवी के लिए, 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 16,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूज करें, और एक पिपेट द्वारा सुपरनैटेंट को छोड़ दें। अवशेषों को कुल्ला करने के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  5. 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस, 16,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, और अनबाउंड डाई को हटाने के लिए सुपरनैटेंट को छोड़ दें।
  6. पीबीएस के 200 μL के साथ अवशेषों को पुन: निलंबित करें। स्लाइड पर निलंबन के 20 μL गिराएं और इसे प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखें।
    नोट: इस प्रक्रिया में, एमवी को एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है।

6. एमएससी-ईवी के स्थानीय प्रत्यारोपण और प्रणालीगत इंजेक्शन

नोट: निम्नलिखित प्रक्रियाओं के लिए, इंजेक्शन से पहले ईवी को बर्फ पर रखें।

  1. नीचे दिए गए चरणों का पालन करके स्थानीय प्रत्यारोपण करें।
    1. चूहों को 4% (वॉल्यूम / वॉल्यूम) आइसोफ्लुरेन के साथ एनेस्थेटाइज करें। प्रक्रिया के दौरान 1% -3% आइसोफ्लुरेन पर संज्ञाहरण बनाए रखें।
    2. सर्जरी से पहले, पोस्टप्रोसेशनल दर्द को कम करने के लिए एनाल्जेसिया के लिए 5 मिलीग्राम / किग्रा कार्प्रोफेन (आईपी) का प्रशासन करें।
    3. घाव काटने से पहले, पृष्ठीय बालों को शेव करें और 10% पोविडोन-आयोडीन और 75% इथेनॉल के 3 वैकल्पिक राउंड लगाकर पृष्ठीय सतह को निष्फल करें।
    4. बायोप्सी पंच ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके, पृष्ठीय त्वचा पर व्यास में 1 सेमी का पूर्ण मोटाई वाला घाव बनाएं।
    5. पीबीएस के 100 μL में दो व्यंजनों से एमएससी-व्युत्पन्न ईवी को फिर से निलंबित करें और चार साइटों के साथ प्रत्येक घाव के चारों ओर घाव बिस्तर की चमड़े के नीचे की परत में इंजेक्शन का प्रशासन करें।
      नोट: प्रति माउस औसतन 100 μg EVs (कोशिकाओं के दो 10 सेमी व्यंजनों से EVs) इंजेक्ट किया जाता है। एक मुराइन मॉडल में एन = 5 का प्रयोग स्थापित करने के लिए पर्याप्त ईवी प्राप्त करने के लिए एमएससी के दस 10 सेमी व्यंजनों की आवश्यकता होती है।
    6. उपचार के बाद, चूहों को बाँझ धुंध के साथ लपेटें और उन्हें गर्मी इन्सुलेशन पैड ( सामग्री की तालिका देखें) पर रखें जब तक कि वे जाग न जाएं।
    7. सुनिश्चित करें कि चूहों को तब तक लावारिस नहीं छोड़ा जाता है जब तक कि वे पर्याप्त होश में नहीं आ जाते। चूहों को अन्य जानवरों की कंपनी में वापस न करें जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक न हो जाएं।
    8. आवश्यकतानुसार सर्जरी के बाद दिन 2 और दिन 3 पर एनाल्जेसिया की अतिरिक्त खुराक दें।
  2. प्रणालीगत इंजेक्शन करें।
    1. पीबीएस के 200 μL में एमएससी-व्युत्पन्न ईवी को पुन: निलंबित करें, और फिर 10: 1 वॉल्यूम अनुपात पर हेपरिन समाधान के साथ मिलाएं।
    2. चूहों को पुच्छल शिरा इमेजिंग सिस्टम में रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। लीवर को उठाने के लिए स्विच दबाएं।
    3. आईवी इंजेक्शन से पहले अल्कोहल पैड का उपयोग करके पूंछ की नस को कीटाणुरहित करें। फिर, पूंछ की नस के माध्यम से चरण 6.2.1 में तैयार निलंबन के साथ चूहों को व्यवस्थित रूप से इंजेक्ट करें। प्रक्रिया को पूंछ की नस इलस्ट्रेटर द्वारा मदद की जाती है।
      नोट: हेपरिन के साथ मिश्रण करने के तुरंत बाद ईवी निलंबन इंजेक्ट करें। प्रति माउस औसतन 100 μg EVs (कोशिकाओं के दो 10 सेमी व्यंजनों से ईवी) इंजेक्ट किया जाता है। एक मुराइन मॉडल में एन = 5 का प्रयोग स्थापित करने के लिए पर्याप्त ईवी प्राप्त करने के लिए एमएससी के दस 10 सेमी व्यंजनों की आवश्यकता होती है।
      चेतावनी: माउस टेल नस इंजेक्शन आमतौर पर मात्रा के 200 μl तक सीमित होता है। इंजेक्शन को धीरे-धीरे जाना चाहिए और यदि आपको टक्कर या प्रतिरोध दिखाई देता है, तो बंद हो जाना चाहिए, जिससे पता चलता है कि सुई नस से बाहर है। यदि चूहे कर्लिंग और कंपकंपी जैसे प्रतिकूल नैदानिक लक्षण दिखाते हैं, तो यह उच्च मात्रा वाले इंजेक्शन, फास्ट इंजेक्शन, या विषाक्तता / एनाफिलेक्सिस के लिए एक सदमे की प्रतिक्रिया हो सकती है।

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Representative Results

सुसंस्कृत मानव यूसीएमएससी से एमवी और एक्सोस को प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो (चित्रा 1) के बाद अलग किया जाता है। एनटीए के परिणाम दर्शाते हैं कि मानव एमएससी से एक्सोस का आकार लगभग 100 एनएम के शिखर आकार के साथ 40 एनएम से 335 एनएम तक होता है, और एमवी का आकार 150 एनएम के शिखर आकार के साथ 50 एनएम से 445 एनएम तक होता है (चित्रा 2)। एमएससी-व्युत्पन्न एक्सोस के रूपात्मक लक्षण वर्णन एक विशिष्ट कप आकार प्रदर्शित करते हैं (चित्रा 3)। ईवी को कुशलतापूर्वक पीकेएच 26 द्वारा लेबल किया जाता है, जिसे लेबल किए गए छर्रों के रूप में सकल दृश्य और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) दोनों द्वारा देखा जाता है। एमएससी-व्युत्पन्न ईवी के स्थानीय और प्रणालीगत इंजेक्शन त्वचा के घाव के आसपास या पुच्छल नस के माध्यम से किए जाते हैं (चित्रा 5)। इस प्रकार, एक्सोस और एमवी को सफलतापूर्वक अलग किया जाता है और बाद के प्रयोगों के लिए लागू किया जाता है।

Figure 1
चित्र 1: सुसंस्कृत मानव एमएससी से एमवी और एक्सोस का अलगाव। संस्कृति मीडिया एकत्र किया जाता है और अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एमएससी से एक्सोस और एमवी का एनटीए विश्लेषण। प्रतिनिधि छवियों के साथ कण आकार वितरण दर्शाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: टीईएम द्वारा एमएससी से एक्सोस का आकृति विज्ञान लक्षण वर्णन। कप के आकार के एक्सोस प्रदर्शित किए जाते हैं। स्केल बार: 200 एनएम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: पीकेएच 26 द्वारा एमएससी-व्युत्पन्न एमवी की लेबलिंग। पीकेएच 26-लेबल एमवी छर्रों को फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत देखा और देखा जाता है। स्केल बार: 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एमएससी-व्युत्पन्न ईवी का प्रशासन। (ए) त्वचा के घाव के आसपास स्थानीय प्रत्यारोपण और (बी) पुच्छल नस के माध्यम से प्रणालीगत इंजेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एंटीजन प्रस्तुति, आनुवंशिक सामग्री परिवहन, सेल माइक्रोएन्वायरमेंट संशोधन और अन्य सहित विभिन्न जैविक गतिविधियों में ईवी एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए उभर रहे हैं। इसके अलावा, उनका व्यापकअनुप्रयोग रोगों के निदान और उपचार के लिए नए दृष्टिकोण और अवसर लाता है। ईवी के चिकित्सीय अनुप्रयोगों का कार्यान्वयन सफल अलगाव और लक्षण वर्णन पर आधारित है। हालांकि, मानकीकृत अलगाव और शुद्धिकरण विधियों की कमी और कम निष्कर्षण दक्षता के कारण, ईवी अनुसंधान में बाधा आई है। यह लेख मुख्य रूप से सुसंस्कृत मानव एमएससी और आगे के अनुप्रयोगों से ईवी के आसानी से संभव निष्कर्षण और लक्षण वर्णन प्रोटोकॉल का परिचय देता है, जिसे लेबल किया जा सकता है और स्थानीय इंजेक्शन के माध्यम से ऊतक की मरम्मत को बढ़ावा देने और अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा प्रणालीगत रोगों का इलाज करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ईवी अलगाव के लिए एमएससी की प्रजनन क्षमता यूसीएमएससी की नवजात उत्पत्ति, कोशिकाओं की मानक संस्कृति और बिना किसी देरी मार्ग का उपयोग करके संरक्षित की जाती है। यद्यपि एक्सोस और एमवी शब्द का उपयोग क्रमशः इस पांडुलिपि में अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन गति से एकत्र किए गए ईवी को संदर्भित करने के लिए किया जाता है, लेकिन उनकी उत्पत्ति को अलग करने के लिए भविष्य के अध्ययनों में अधिक परख की आवश्यकता होगी, जैसा कि एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स के अध्ययन के लिए न्यूनतम सूचना (एमआईएसईवी 2018) 22 दिशानिर्देश द्वारा अनुशंसित है, जैसे कि उत्पादन प्रक्रिया का अवलोकन करने के लिए लाइव-सेल इमेजिंग द्वारा और विशिष्ट मार्करों का पता लगाने के लिए इम्यूनो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा। कुल मिलाकर, विधि सरल है और इस प्रकार आसानी से स्केलेबल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, जो क्षेत्र के लिए उपयोगी होगी।

वर्तमान अध्ययन में, एमएससी से शारीरिक ईवी को अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एमवी और एक्सोस में उत्तरोत्तर अलग किया जाता है। यहां, संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करने के लिए 20% ईवी-क्षीण एफबीएस के साथ पूरक α-एमईएम को बदलने के महत्व पर जोर दिया गया है। यह कदम यह सुनिश्चित करता है कि निकाले गए ईवी केवल एमएससी से प्राप्त होते हैं, इस संभावना को छोड़कर कि ईवी अन्य हस्तक्षेप करने वाले पदार्थों से हो सकते हैं। प्रणालीगत इंजेक्शन से पहले ईवी समाधान में 10% हेपरिन समाधान को मिलाना भी महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से पता चला है कि ईवी में प्रोकोगुलेंट प्रभाव होता है, इसलिए इंजेक्शन के बाद थ्रोम्बस के गठन से बचने के लिए प्रणालीगत इंजेक्शन के दौरान हेपरिन जोड़ना आवश्यक है, जोअन्यथा चूहों की तीव्र घातकता की ओर जाता है। इस प्रोटोकॉल कार्यान्वयन के दौरान कुछ समस्याएँ हो सकती हैं जिनके लिए समस्या निवारण की आवश्यकता होती है. एक प्रमुख उदाहरण के लिए, यदि ईवी की निष्कर्षण मात्रा पर्याप्त नहीं है, तो शोधकर्ताओं को इसे सेल सुपरनैटेंट संग्रह चरण में वापस पता लगाना चाहिए। सतह पर तैरनेवाला संग्रह के दौरान, एमएससी के बाह्य मैट्रिक्स में बरकरार जारी ईवी को पूरी तरह से इकट्ठा करने के लिए कोशिकाओं को समान रूप से उड़ाया जाना चाहिए। एक और संभावित विफलता तब होती है जब ईवी के इंजेक्शन के तुरंत बाद चूहे मर जाते हैं। इंजेक्शन से पहले हेपरिन जोड़ने के अलावा, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, इंजेक्शन ईवी की एकाग्रता (प्रति माउस औसतन 100 μg EVs) को समायोजित किया जाना चाहिए। इंजेक्शन की सफलता को सत्यापित करने के लिए, प्रतिदीप्ति-लेबल ईवी के जैव वितरण के विवो इमेजिंग में या एन्ग्राफमेंट के विशिष्ट ऊतक साइटों (यकृत, प्लीहा, आदि) के जमे हुए वर्गों का प्रदर्शन किया जा सकता है, जो पहले24 रिपोर्ट किया गया था। इसके अलावा, ईवी को अलगाव के बाद जितनी जल्दी हो सके उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, और ठंड भंडारण कण हानि, शुद्धता में कमी और संलयन घटना का कारण बनेगा जिससे कलात्मक कण25 हो जाएंगे। इसके अलावा, आमतौर पर अपनाए गए पीकेएच 26 लेबलिंग ईवी आकार26 को बढ़ाएगा, और तुलना के लिए अन्य लेबलिंग विधियों का उपयोग किया जा सकता है।

ईवी को अलग करने के लिए मौजूदा प्रोटोकॉल मुख्य रूप से निम्नानुसार रिपोर्ट किए गए हैं: अंतर और घनत्व ढाल अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन9, अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया10, इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण 11, आणविक बहिष्करण क्रोमैटोग्राफ 12, माइक्रोफ्लुइडिक चिप 13, और बहुलक-आधारित वर्षा प्रौद्योगिकी27। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन की तुलना में, अल्ट्राफिल्ट्रेशन प्रक्रिया एक सुविधाजनक निष्कर्षण विधि है और बड़ी मात्राके नमूनों 9,10 में ईवी के संवर्धन के लिए अनुकूल है, जबकि नुकसान यह है कि झिल्ली प्रदूषण है, जो नमूना हानि का कारण बनना आसान है। इम्यूनोमैग्नेटिक पृथक्करण ईवी के विभिन्न उपप्रकारों को अलग करने के लिए उपयुक्त है, और प्राप्त ईवी में उच्च शुद्धता है। इस विधि का नुकसान कम उपज के साथ उच्च लागतहै। आणविक बहिष्करण क्रोमैटोग्राफ द्वारा अलग किए गए ईवी में उच्च शुद्धता और उच्च उपज होती है। नुकसान यह है कि विशेष उपकरण की आवश्यकता होती है और एकही समय में कई नमूनों के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है। माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में उच्च लागत के साथ सामग्री और प्रौद्योगिकी के लिए उच्च आवश्यकताएं होती हैं, औरबड़े नमूनों को संसाधित करना मुश्किल होता है। बहुलक-आधारित वर्षा प्रौद्योगिकी द्वारा अलग किए गए ईवी में गैर-ईवी संदूषक होते हैं जो ईवी गतिविधि14 को प्रभावित करेंगे। उनमें से, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन अभी भी ईवी के पृथक्करण और शुद्धिकरण के लिए सबसे व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है और इसे एमएससी-ईवी निष्कर्षण के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है। एमएससी संस्कृति मीडिया से ईवी का पृथक्करण और संवर्धन सेंट्रीफ्यूजेशन के विभिन्न समय और गति के संयोजन के माध्यम से कदम से कदम हासिल किया जाता है, जो एक अनुकूलित विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह उल्लेखनीय है कि इस पांडुलिपि में पृथक एक्सोस और एमवी में समान आकार वितरण हैं, हालांकि एमवी बड़े होते हैं, जो अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के कारण हो सकता है जो नैनोकणों के एकत्रीकरण को प्रेरित करता है। यद्यपि संशोधित विधियां ईवी के आकार के रखरखाव में बेहतर प्रदर्शन कर सकती हैं, लेकिन ईवी पृथक्करण28 के लिए उच्च दक्षता में अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन फायदेमंद है। हालांकि ईवी और जीएमपी उत्पादन के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए, यह विधि मीडिया की मात्रा से सीमित है जिसे एक अलगाव रन में संसाधित किया जा सकता है, तकनीकी प्रणाली स्थापित करना आसान है औरबड़े जानवरों पर ट्रांसलेशनल परियोजनाओं द्वारा लागू किया गया है। वैसे भी, उपरोक्त पृथक्करण विधियों के अपने फायदे और नुकसान हैं, और शोधकर्ता ईवी के विभिन्न स्रोतों और अनुसंधान उद्देश्य के अनुसार उपयुक्त विधि चुन सकते हैं।

हाल के वर्षों में, ईवी ने नैदानिक अनुप्रयोगों में बड़ी क्षमता दिखाई है, जैसे कि रोग निदान 31, उपचार, और दवा वितरण के वाहक32,33 के रूप में। उनके लाभप्रद गुणों के आधार पर, विभिन्न देशों ने चिकित्सीय एजेंटों के रूप में ईवी का व्यापक रूप से अध्ययन किया है। इस संबंध में, रोग उपचार में ईवी और रोग के रोगजनन में ईवी की भूमिका को अंतर्निहित तंत्र के लिए अध्ययन किया गया है। सुसंस्कृत एमएससी से ईवी के अलगाव, लक्षण वर्णन और चिकित्सीय अनुप्रयोग के वर्तमान प्रोटोकॉल को अच्छी तरह से लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, त्वचा के घावों में एमएससी-एक्सोस की स्थानीय डिलीवरी भड़काऊ मॉड्यूलेशन द्वारा उपचार को बढ़ावा देती है और एमएससी-व्युत्पन्न ईवी के पूंछ-नस इंजेक्शन टाइप 2 मधुमेह मेलेटस24 में यकृत इंसुलिन प्रतिरोध और स्टीटोसिस में सुधार कर सकते हैं। इसके अलावा, एमएससी-ईवी की बढ़ी हुई उपज और शुद्धता से जुड़े चिकित्सीय अनुप्रयोग व्यवहार्य अनुवाद रणनीतियों को प्रदान करने के लिए क्षितिज पर हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32000974, 81930025 और 82170988) और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2019 एम 663986 और बीएक्स 20190380) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। हम नेशनल एक्सपेरिमेंटल टीचिंग डेमॉन्स्ट्रेशन सेंटर फॉर बेसिक मेडिसिन (एएमएफयू) और वायु सेना मेडिकल यूनिवर्सिटी के सैन्य चिकित्सा नवाचार केंद्र के विश्लेषणात्मक और परीक्षण केंद्रीय प्रयोगशाला की सहायता के लिए आभारी हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% povidone-iodine (Betadine) Weizhenyuan 10053956954292 Wound disinfection
Calibration solution Particle Metrix 110-0020 Calibrate the NTA instrument
Carprofen Sigma 53716-49-7 Analgesic medicine
Caudal vein imager  KEW Life Science KW-XXY Caudal vein imager
Centrifuge Eppendorf 5418R Centrifugation
Fatal bovine serum Corning 35-081-CV Culture of UCMSCs
Formvar/carbon-coated square mesh PBL Assay Science  24916-25 Transmission electron microscope
Heating pad Zhongke Life Science Z8G5JBMz Post-treatment care of animals
Heparin Solution StemCell 7980 Systemic injection
Isoflurane RWD Life Science R510-22 Animal anesthesia
Minimum Essential Medium Alpha basic (1x) Gibco C12571500BT Culture of UCMSCs
Nanoparticle tracking analyzer Particle Metrix ZetaView PMX120 Nanoparticle tracking analysis
PBS (1x) Meilunbio MA0015 Resuspend EVs
Penicillin/Streptomycin Procell Life Science PB180120 Culture of UCMSCs
Phosphotungstic acid Solarbio 12501-23-4 Transmission electron microscope
Pipette Eppendorf 3120000224
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit Sigma-Aldrich MINI26 Labeling EVs
Skin biopsy punch Acuderm 69038-10-50 Skin defects
Software ZetaView Particle Metrix Version 8.05.14 SP7 
Thermostatic equipment Grant v-0001-0005 Water bath
Transmission electron microscope HITACHI HT7800 Transmission electron microscope
UCMSCs Bai'ao  UKK220201 Commercially UCMSCs
Ultracentrifuge Beckman XPN-100 Centrifugation
Ultrapure filtered water purification system Milli-Q IQ 7000 Preparation of ultrapure water

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References

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जीव विज्ञान अंक 187
सुसंस्कृत मानव मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं से बाह्य पुटिकाओं का अलगाव, लक्षण वर्णन और चिकित्सीय अनुप्रयोग
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Xing, S. J., Zhang, K. C., Tang, S.… More

Xing, S. J., Zhang, K. C., Tang, S. Y., Liu, L., Cao, Y., Zheng, C. X., Sui, B. D., Jin, Y. Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (187), e64135, doi:10.3791/64135 (2022).

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