בידוד של תאי אנדותל גלומרולריים של עכברים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית
Summary
המאמר מתאר את השיטה לבידוד תאי אנדותל גלומרולריים מותנים מכליות של עכברים מהונדסים המבטאים את נגיף סימיאן התרמולבילי 40 ואת המיטוכונדריה הניתנת להפעלה פוטו-אקטיבית, PhAMנכרת. אנו מתארים את ההליך לבידוד גלומרולי מכליות שלמות באמצעות חרוזים, שלבי עיכול, זריעה וגידול של GECs-CD31 חיובי.
Abstract
תפקוד לקוי של תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) יכול ליזום ולתרום לפירוק מחסום סינון גלומרולרי. עקה חמצונית מיטוכונדריאלית מוגברת הוצעה כמנגנון הגורם לתפקוד לקוי של GEC בפתוגנזה של מחלות גלומרולריות מסוימות. מבחינה היסטורית, הבידוד של GECs ממודלים in vivo היה מאתגר לשמצה בשל קשיים בבידוד תרבויות טהורות מגלומרולי. ל-GECs יש דרישות גידול מורכבות במבחנה ותוחלת חיים מוגבלת מאוד. במאמר זה נתאר את הליך הבידוד וההתרבות של GECs מונצחים מותנים עם מיטוכונדריה פלואורסצנטית, מה שמאפשר מעקב אחר ביקוע מיטוכונדריאלי ואירועי היתוך. GECs בודדו מכליות של עכבר מהונדס כפול המבטא את התרמולביל SV40 TAg (מה-Immortomouse), מקדם באופן מותנה התפשטות ודיכוי התמיינות תאים, וחלבון פלואורסצנטי הניתן להמרה (Dendra2) בכל המיטוכונדריה (מהעכבר המיטוכונדריה הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית [PhAMנכרת]). קו התאים היציב שנוצר מאפשר התמיינות תאים לאחר השבתה של הגן האמונטלי SV40 TAg והפעלה פוטו-אקטיבית של תת-קבוצה של מיטוכונדריה הגורמת למתג בפלואורסצנטיות מירוק לאדום. השימוש ב-mitoDendra2-GECs מאפשר הדמיה חיה של אירועי התפלגות, איחוי וביקוע של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מבלי להכתים את התאים.
Introduction
הגלומרולוס חיוני לסינון הדם על ידי הגבלת המעבר של מולקולות גדולות דרך מחסום הסינון הגלומרולרי 1,2. הגלומרולוס מכיל ארבעה סוגי תאים: תאי אפיתל קודקודיים, פודוציטים (תאי אפיתל קרביים), תאי אנדותל גלומרולריים (GEC) ותאים מסנגיאליים3. האנדותל הגלומרולרי מאופיין במבנה כלי דם ייחודי, בהתאם לנוכחות של fenestrae הנדרשת לנפחי סינון גדולים4. המשטח האפיקלי של האנדותל הגלומרולרי מכוסה בשכבת גליקוקליקס טעונה שלילית ובשכבה הנקראת שכבת פני השטח של האנדותל היוצרת רווח בין האנדותל לדם. מבנה זה מספק סלקטיביות מטען גבוהה המגבילה את המעבר של מולקולות טעונות שלילית כגון אלבומין ומניעת הידבקות לויקוציטים וטסיות דם5.
GECs רגישים מאוד לשינויים מטבוליים, כגון היפרגליקמיה הקשורה לסביבה הסוכרתית. ואכן, סוכרת מובילה לזרימת דם מוגברת של חומרים רעילים, לרוויה של מסלולי חילוף החומרים של הגלוקוז ולהפרעה במאזן החיזור התאי 3,6. יתר על כן, העלייה בכמות החמצן הריאקטיבי גורמת לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, מה שמשפיע על תפקוד האנדותל7.
המטרה הכוללת של הפרוטוקול הנוכחי היא לבודד תאי אנדותל גלומרולריים מונצחים עם תכונות מיטוכונדריאליות פלואורסצנטיות. ואכן, לתרבית התאים של GECs ראשוניים יש מחזור התפשטות מוגבל וסנסנציה מוקדמת8. בנוסף, נוכחות של מיטוכונדריה פלואורסצנטית מסייעת לבחון אירועי ביקוע ואיחוי בתגובה להיפרגליקמיה או כל טיפול אחר. כשיטה חלופית, מעבדות אחרות השתמשו ב-h-TERT כדי להנציח תאים במבחנה9.
השיטה המתוארת כאן מאפשרת בידוד של תאי האנדותל הגלומרולריים mitoDendra2 המונצחים מותנה מחיות בנות 4-6 שבועות (איור 1). פרוטוקול מפורט זה מתאר את השימוש בעכברים מהונדסים (H-2K b-tsA58) המכילים את נגיף הסימיאן 40 אנטיגן גידולי גדול (SV40 TAg) גן10,11 ליצירת תאים אימורטליים מותנים תרמולביליים. תוצר הגן tsA58 TAg מתפקד בטמפרטורה המתירנית של 33 מעלות צלזיוס תחת שליטתו של מקדם האגפים 5′ הבלתי ניתן להשראה של הגן H-2K b של העכבר, אשר מוגבר מעל הרמות הבסיסיות עם חשיפה לגמא אינטרפרון (IFNγ), ובכך שומר על פנוטיפ ההתפשטות המותנה12. H-2Kb מתפרק במהירות בטמפרטורה הלא מתירנית של 37 מעלות צלזיוס בהיעדר IFNγ, מסיר את הפונקציה המונצחת של tsA58Tag בתאים ומאפשר לתאים לפתח פנוטיפ ממוין יותר13,14,15. חצייה אופציונלית של עכברי H-2Kb-tsA58 מהונדסים עם עכברי PhAM, המבטאים מיטוכונדריה ספציפית (תת-יחידה VIII של ציטוכרום c אוקסידאז) דנדרה2-ירוקה, מאפשרת זיהוי חי של מיטוכונדריה פלואורסצנטית16. פלואורסצנציה ירוקה של Dendra2 עוברת לפלואורסצנציה אדומה לאחר חשיפה ללייזר 405 ננומטר16. כאשר המיטוכונדריה מתמזגים לאחר החלפת תמונות, הם יוצרים צורות מוארכות שנראות צהובות מחילופי חומרים ירוקים וצהובים או נראות אדומות כאשר הן עוברות ביקוע 7,17. MitoDendra2-GECs הם כלי נהדר לחקר התגובות התאיות של מיטוכונדריה של GEC לגירויים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיטוכונדריה חיונית לחילוף החומרים בתאים, להומאוסטזיס ולתגובות סטרס, ותפקוד לקוי שלהם קשור למחלות רבות, כולל מחלות כליות. למיטוכונדריה יש תפקיד ביצירה הפתולוגית של מיני חמצן תגובתי יתר (ROS), בוויסות רמות הסידן התוך-תאי, במסלולי המוות של התאים ובדינמיקה הציטוסקטלית 21,22,23.<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לפרופסור צ’יג’יאנג הוא ולד”ר פו ג’יה על התובנות שלהם בבידוד תאי אנדותל בעכברים ומודים לפרופסור מונה זיידי על שסיפקו את העכבריםשנכרתו על ידי PhAM ודיונים חשובים. המחברים רוצים גם להודות למיקרוסקופיה CORE בבית הספר לרפואה של אייקן בהר סיני ולצוות על ההדרכה שקיבלנו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות מענק R01DK097253 ומענק CDMRP של משרד ההגנה E01 W81XWH2010836 ל- I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
