Aislamiento de células endoteliales glomerulares de ratón condicionalmente inmortalizadas con mitocondrias fluorescentes
Summary
El artículo describe el método para aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas condicionalmente de los riñones de ratones transgénicos que expresan el virus simio termolábil 40 y las mitocondrias fotoactivables, PhAMextirpado. Describimos el procedimiento para el aislamiento de glomérulos de riñones enteros utilizando perlas, pasos de digestión, siembra y cultivo de GECs-CD31 positivos.
Abstract
La disfunción de las células endoteliales glomerulares (GEC) puede iniciar y contribuir a la ruptura de la barrera de filtración glomerular. El aumento del estrés oxidativo mitocondrial se ha sugerido como un mecanismo que resulta en la disfunción del GEC en la patogénesis de algunas enfermedades glomerulares. Históricamente, el aislamiento de los GEC de los modelos in vivo ha sido notoriamente desafiante debido a las dificultades para aislar los cultivos puros de los glomérulos. Los GEC tienen requisitos de crecimiento complejos in vitro y una vida útil muy limitada. Aquí, describimos el procedimiento para aislar y cultivar GEC inmortalizados condicionalmente con mitocondrias fluorescentes, lo que permite el seguimiento de los eventos de fisión y fusión mitocondrial. Los GEC se aislaron de los riñones de un ratón transgénico doble que expresaba el TAg SV40 termolábil (del Immortomouse), promoviendo condicionalmente la proliferación y suprimiendo la diferenciación celular, y una proteína fluorescente fotoconvertible (Dendra2) en todas las mitocondrias (del ratón mitocondria fotoactivable [PhAMextirpado]). La línea celular estable generada permite la diferenciación celular después de la inactivación del gen inmortalizante SV40 TAg y la fotoactivación de un subconjunto de mitocondrias que causan un cambio en la fluorescencia de verde a rojo. El uso de mitoDendra2-GEC permite obtener imágenes en vivo de los eventos de distribución, fusión y fisión de las mitocondrias fluorescentes sin teñir las células.
Introduction
El glomérulo es crítico para la filtración de la sangre al restringir el paso de moléculas grandes a través de la barrera de filtración glomerular 1,2. El glomérulo contiene cuatro tipos de células: células epiteliales parietales, podocitos (células epiteliales viscerales), células endoteliales glomerulares (GEC) y células mesangiales3. El endotelio glomerular se caracteriza por una estructura vascular única, según la presencia de fenestra requerida para grandes volúmenes de filtración4. La superficie apical del endotelio glomerular está cubierta con una capa de glicocálix cargada negativamente y una capa llamada capa superficial endotelial que crea un espacio entre el endotelio y la sangre. Esta estructura proporciona una alta selectividad de carga que restringe el paso de moléculas cargadas negativamente como la albúmina y previene la adhesión de leucocitos y plaquetas5.
Los GEC son muy sensibles a los cambios metabólicos, como la hiperglucemia asociada con el medio diabético. De hecho, la diabetes conduce a un aumento de la circulación de sustancias nocivas, la saturación de las vías del metabolismo de la glucosa y el equilibrio redox celular alterado 3,6. Además, el aumento de especies reactivas de oxígeno induce disfunción mitocondrial, que afecta la función endotelial7.
El objetivo general del protocolo actual es aislar células endoteliales glomerulares inmortalizadas con características mitocondriales fluorescentes. De hecho, el cultivo celular de GEC primarios tiene un ciclo proliferativo limitado y senescencia temprana8. Además, la presencia de mitocondrias fluorescentes ayuda a examinar los eventos de fisión y fusión en respuesta a la hiperglucemia o cualquier otro tratamiento. Como método alternativo, otros laboratorios utilizaron h-TERT para inmortalizar células in vitro9.
El método descrito aquí permite el aislamiento de células endoteliales glomerulares mitoDendra2 inmortalizadas condicionalmente de animales de 4-6 semanas de edad (Figura 1). Este protocolo detallado describe el uso de ratones transgénicos (H-2K b-tsA58) que albergan el gen 10,11 del antígeno tumoral grande del virus simio 40 (SV40 TAg) para generar células termolábiles inmortalizadas condicionalmente. El producto del gen tsA58 TAg es funcional a la temperatura permisiva de 33 °C bajo el control del promotor flanqueante 5′ inducible del gen H-2K b de ratón, que aumenta por encima de los niveles basales tras la exposición al interferón gamma (IFNγ), manteniendo así el fenotipo de proliferación condicional12. H-2Kb se degrada rápidamente a la temperatura no permisiva de 37 °C en ausencia de IFNγ, eliminando la función inmortalizante del tsA58Tag en las células y permitiendo que las células desarrollen un fenotipo más diferenciado13,14,15. El cruce opcional de ratones transgénicos H-2Kb-tsA58 con ratones PhAM, que expresan una mitocondria específica (subunidad VIII de la citocromo c oxidasa) Dendra2-verde, permite la detección en vivo de mitocondriasfluorescentes 16. La fluorescencia verde Dendra2 cambia a fluorescencia roja después de la exposición a un láser de 405 nm16. Cuando las mitocondrias se fusionan después del fotocambio, forman formas alargadas que aparecen amarillas por el intercambio de material verde y amarillo o aparecen rojas cuando se someten a fisión 7,17. Los mitoDendra2-GECs son una gran herramienta para estudiar las respuestas celulares de las mitocondrias GEC a diferentes estímulos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las mitocondrias son críticas para el metabolismo celular, la homeostasis y las respuestas al estrés, y su disfunción está relacionada con muchas enfermedades, incluida la enfermedad renal. Las mitocondrias tienen un papel en la generación patológica de especies reactivas excesivas de oxígeno (ROS), la regulación de los niveles de calcio intracelular, las vías de muerte celular y la dinámica citoesquelética21,22,23.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al profesor Cijiang He y al Dr. Fu Jia por sus ideas sobre el aislamiento de células endoteliales de ratones y agradecen al profesor Mone Zaidi por proporcionar los ratonesextirpados PhAM y valiosas discusiones. Los autores también desean agradecer el CORE de Microscopía en la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai y al personal por la orientación que recibimos. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud subvención R01DK097253 y la subvención CDMRP del Departamento de Defensa E01 W81XWH2010836 a I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
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