Isolamento di cellule endoteliali glomerulari di topo condizionatamente immortalizzate con mitocondri fluorescenti
Summary
L’articolo descrive il metodo per isolare cellule endoteliali glomerulari condizionatamente immortalizzate dai reni di topi transgenici che esprimono il virus termolabile delle scimmie 40 e mitocondri fotoattivabili, PhAMasportato. Descriviamo la procedura per l’isolamento dei glomeruli da reni interi usando perline, fasi di digestione, semina e coltura di GEC-CD31 positivi.
Abstract
La disfunzione delle cellule endoteliali glomerulari (GEC) può avviare e contribuire alla rottura della barriera di filtrazione glomerulare. L’aumento dello stress ossidativo mitocondriale è stato suggerito come meccanismo che provoca la disfunzione GEC nella patogenesi di alcune malattie glomerulari. Storicamente l’isolamento degli OG dai modelli in vivo è stato notoriamente impegnativo a causa delle difficoltà nell’isolare colture pure dai glomeruli. Gli OG hanno requisiti di crescita complessi in vitro e una durata di vita molto limitata. Qui, descriviamo la procedura per isolare e coltivare GEC condizionatamente immortalati con mitocondri fluorescenti, consentendo il monitoraggio degli eventi di fissione e fusione mitocondriale. I GEC sono stati isolati dai reni di un topo transgenico doppio che esprime il termolabile SV40 TAg (dall’Immortomouse), promuovendo condizionatamente la proliferazione e sopprimendo la differenziazione cellulare, e una proteina fluorescente fotoconvertibile (Dendra2) in tutti i mitocondri (dal topo mitocondriale fotoattivabile). La linea cellulare stabile generata consente la differenziazione cellulare dopo l’inattivazione del gene immortalizzante SV40 TAg e la foto-attivazione di un sottogruppo di mitocondri causando un passaggio della fluorescenza dal verde al rosso. L’uso di mitoDendra2-GEC consente l’imaging dal vivo degli eventi di distribuzione, fusione e fissione dei mitocondri fluorescenti senza colorare le cellule.
Introduction
Il glomerulo è fondamentale per la filtrazione del sangue limitando il passaggio di grandi molecole attraverso la barriera di filtrazione glomerulare 1,2. Il glomerulo contiene quattro tipi di cellule: cellule epiteliali parietali, podociti (cellule epiteliali viscerali), cellule endoteliali glomerulari (GEC) e cellule mesangiali3. L’endotelio glomerulare è caratterizzato da una struttura vascolare unica, come per la presenza di fenestrae richieste per grandi volumi di filtrazione4. La superficie apicale dell’endotelio glomerulare è ricoperta da uno strato di glicocalice caricato negativamente e da un rivestimento chiamato strato superficiale endoteliale che crea uno spazio tra l’endotelio e il sangue. Questa struttura fornisce un’elevata selettività della carica limitando il passaggio di molecole caricate negativamente come l’albumina e impedendo l’adesione di leucociti e piastrine5.
Gli OG sono molto sensibili ai cambiamenti metabolici, come l’iperglicemia associata all’ambiente diabetico. Infatti, il diabete porta ad un aumento della circolazione di sostanze nocive, alla saturazione delle vie del metabolismo del glucosio e a disturbi dell’equilibrio redox cellulare 3,6. Inoltre, l’aumento delle specie reattive dell’ossigeno induce disfunzione mitocondriale, che influisce sulla funzione endoteliale7.
L’obiettivo generale dell’attuale protocollo è quello di isolare cellule endoteliali glomerulari immortalizzate con caratteristiche mitocondriali fluorescenti. Infatti, la coltura cellulare di GEC primari ha un ciclo proliferativo limitato e una senescenza precoce8. Inoltre, la presenza di mitocondri fluorescenti aiuta a esaminare gli eventi di fissione e fusione in risposta all’iperglicemia o a qualsiasi altro trattamento. Come metodo alternativo, altri laboratori hanno utilizzato h-TERT per immortalare le cellule in vitro9.
Il metodo qui descritto consente l’isolamento di cellule endoteliali glomerulari mitoDendra2 condizionatamente immortalate da animali di 4-6 settimane (Figura 1). Questo protocollo dettagliato descrive l’uso di topi transgenici (H-2K b-tsA58) che ospitano il gene 10,11 del virus delle scimmie 40 Large Tumor Antigene (SV40 TAg) per generare cellule termolabili condizionatamente immortalate. Il prodotto del gene tsA58 TAg è funzionale alla temperatura permissiva di 33 °C sotto il controllo del promotore 5′ fiancheggiante inducibile del gene H-2Kb del topo, che viene aumentato al di sopra dei livelli basali dopo esposizione all’interferone gamma (IFNγ), mantenendo quindi il fenotipo di proliferazione condizionale12. H-2Kb viene rapidamente degradato alla temperatura non permissiva di 37 °C in assenza di IFNγ, rimuovendo la funzione immortalizzante del tsA58Tag nelle cellule e permettendo alle cellule di sviluppare un fenotipo 13,14,15 più differenziato. L’incrocio opzionale di topi transgenici H-2Kb-tsA58 con topi PhAM, che esprimono un mitocondrio-specifico (subunità VIII della citocromo c ossidasi) Dendra2-green, consente la rilevazione in tempo reale di mitocondri fluorescenti16. La fluorescenza verde Dendra2 passa alla fluorescenza rossa dopo l’esposizione a un laser16 a 405 nm. Quando i mitocondri si fondono dopo il foto-switching, formano forme allungate che appaiono gialle dallo scambio di materiale verde e giallo o appaiono rosse quando subiscono la fissione 7,17. I mitoDendra2-GEC sono un ottimo strumento per studiare le risposte cellulari dei mitocondri GEC a diversi stimoli.
Protocol
Representative Results
Discussion
I mitocondri sono fondamentali per il metabolismo cellulare, l’omeostasi e le risposte allo stress e la loro disfunzione è legata a molte malattie, tra cui le malattie renali. I mitocondri hanno un ruolo nella generazione patologica di specie reattive eccessive dell’ossigeno (ROS), nella regolazione dei livelli intracellulari di calcio, nelle vie di morte cellulare e nella dinamica citoscheletrica21,22,23.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il professor Cijiang He e il dottor Fu Jia per le loro intuizioni sull’isolamento delle cellule endoteliali dei topi e ringraziano il professor Zaidi per aver fornito i topiasportati PhAM e preziose discussioni. Gli autori vorrebbero anche riconoscere il Microscopy CORE presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai e lo staff per la guida che abbiamo ricevuto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health grant R01DK097253 e Department of Defense CDMRP grant E01 W81XWH2010836 a I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
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