Isolering av villkorligt förevigade musglomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondrier
Summary
Artikeln beskriver metoden för att isolera villkorligt förevigade glomerulära endotelceller från njurarna hos transgena möss som uttrycker det termolabila simianviruset 40 och fotoaktiverbara mitokondrier, PhAMutskurna. Vi beskriver proceduren för glomeruliisolering från hela njurar med hjälp av pärlor, matsmältningssteg, sådd och odling av GEC-CD31-positiva.
Abstract
Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunktion kan initiera och bidra till glomerulär filtreringsbarriärnedbrytning. Ökad mitokondriell oxidativ stress har föreslagits som en mekanism som resulterar i GEC-dysfunktion i patogenesen av vissa glomerulära sjukdomar. Historiskt sett har isoleringen av GEC från in vivo-modeller varit notoriskt utmanande på grund av svårigheter att isolera rena kulturer från glomeruli. GEC har komplexa tillväxtkrav in vitro och en mycket begränsad livslängd. Här beskriver vi proceduren för att isolera och odla villkorligt förevigade GEC med fluorescerande mitokondrier, vilket möjliggör spårning av mitokondriell fission och fusionshändelser. GEC isolerades från njurarna hos en dubbel transgen mus som uttrycker den termolabila SV40 TAg (från Immortomouse), vilket villkorligt främjar proliferation och undertrycker celldifferentiering och ett fotokonvertibelt fluorescerande protein (Dendra2) i alla mitokondrier (från den fotoaktiverbara mitokondrierna [PhAMutskuren] musen). Den stabila cellinjen som genereras möjliggör celldifferentiering efter inaktivering av den odödliga SV40 TAg-genen och fotoaktivering av en delmängd av mitokondrier som orsakar en övergång i fluorescens från grönt till rött. Användningen av mitoDendra2-GEC möjliggör levande avbildning av fluorescerande mitokondriers distribution, fusion och fissionshändelser utan att färga cellerna.
Introduction
Glomerulus är avgörande för blodfiltrering genom att begränsa passagen av stora molekyler genom den glomerulära filtreringsbarriären 1,2. Glomerulus innehåller fyra celltyper: parietala epitelceller, podocyter (viscerala epitelceller), glomerulära endotelceller (GEC) och mesangiala celler3. Det glomerulära endotelet kännetecknas av en unik vaskulär struktur, enligt närvaron av fenestrae som krävs för stora filtreringsvolymer4. Den apikala ytan av det glomerulära endotelet är täckt med ett negativt laddat glykokalyxskikt och en beläggning som kallas endotelytskiktet som skapar ett utrymme mellan endotelet och blodet. Denna struktur ger hög laddningsselektivitet som begränsar passagen av negativt laddade molekyler såsom albumin och förhindrar leukocyt- och trombocytadhesion5.
GEC är mycket känsliga för metaboliska förändringar, såsom hyperglykemi i samband med diabetesmiljön. Faktum är att diabetes leder till ökad cirkulation av skadliga ämnen, mättnad av glukosmetabolismvägar och störd cellulär redoxbalans 3,6. Dessutom inducerar ökningen av reaktiva syrearter mitokondriell dysfunktion, vilket påverkar endotelfunktionen7.
Det övergripande målet med det nuvarande protokollet är att isolera odödliga glomerulära endotelceller med fluorescerande mitokondriella egenskaper. Faktum är att cellkulturen hos primära GEC har en begränsad proliferativ cykel och tidig åldrande8. Dessutom hjälper närvaron av fluorescerande mitokondrier att undersöka fissions- och fusionshändelser som svar på hyperglykemi eller någon annan behandling. Som en alternativ metod använde andra laboratorier h-TERT för att föreviga celler in vitro9.
Metoden som beskrivs här möjliggör isolering av villkorligt odödliggjorda mitoDendra2 glomerulära endotelceller från 4-6 veckor gamla djur (Figur 1). Detta detaljerade protokoll beskriver användningen av transgena möss (H-2K b-tsA58) som hyser simianvirus 40 stort tumörantigen (SV40 TAg) gen10,11 för att generera termolabila villkorligt odödliga celler. TSA58 TAg-genprodukten är funktionell vid den tillåtna temperaturen 33 °C under kontroll av den inducerbara 5′-flankerande promotorn för musens H-2Kb-gen, som ökas över basalnivåerna vid exponering för interferon gamma (IFNγ), vilket upprätthåller den villkorliga proliferationsfenotypen12. H-2Kb bryts snabbt ned vid den icke-tillåtna temperaturen 37 °C i frånvaro av IFNγ, vilket avlägsnar den förevigande funktionen hos tsA58Tag i celler och låter cellerna utveckla en mer differentierad fenotyp13,14,15. Valfri korsning av H-2Kb-tsA58 transgena möss med PhAM-möss, som uttrycker en mitokondrierspecifik (subenhet VIII av cytokrom c-oxidas) Dendra2-grön, möjliggör levande detektion av fluorescerande mitokondrier16. Dendra2 grön fluorescens växlar till röd fluorescens efter exponering för en 405 nm laser16. När mitokondrier smälter samman efter fotobyte bildar de långsträckta former som verkar gula från utbytet av grönt och gult material eller verkar röda när de genomgår fission 7,17. MitoDendra2-GEC är ett utmärkt verktyg för att studera de cellulära svaren från GEC mitokondrier på olika stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitokondrier är avgörande för cellulär metabolism, homeostas och stressreaktioner, och deras dysfunktion är kopplad till många sjukdomar, inklusive njursjukdom. Mitokondrier har en roll i den patologiska genereringen av överdriven reaktiva syrearter (ROS), regleringen av intracellulära kalciumnivåer, celldödsvägar och cytoskeletal dynamik21,22,23.
Isoleringen av murina GEC är utmanande på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar professor Cijiang He och Dr. Fu Jia för deras insikter i möss endotelcellisolering och tackar professor Mone Zaidi för att ha tillhandahållit dePhAM-utskurna mössen och värdefulla diskussioner. Författarna vill också erkänna mikroskopi CORE vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai och personal för den vägledning vi fick. Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health-bidrag R01DK097253 och Department of Defense CDMRP-bidrag E01 W81XWH2010836 till I.S.D.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
- Daehn, I. S., Duffield, J. S. The glomerular filtration barrier: A structural target for novel kidney therapies. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (10), 770-788 (2021).
- Fu, J., Lee, K., Chuang, P. Y., Liu, Z., He, J. C. Glomerular endothelial cell injury and cross talk in diabetic kidney disease. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 308 (4), 287-297 (2015).
- Lassen, E., Daehn, I. S. Molecular mechanisms in early diabetic kidney disease: Glomerular endothelial cell dysfunction. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9456 (2020).
- Haraldsson, B., Jeansson, M. Glomerular filtration barrier. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 18 (4), 331-335 (2009).
- Yilmaz, O., Afsar, B., Ortiz, A., Kanbay, M. The role of endothelial glycocalyx in health and disease. Clinical Kidney Journal. 12 (5), 611-619 (2019).
- Giacco, F., Brownlee, M. Oxidative stress and diabetic complications. Circulation Research. 107 (9), 1058-1070 (2010).
- Daehn, I. S. Glomerular endothelial cell stress and cross-talk With podocytes in early [corrected] diabetic kidney disease. Frontiers in Medicine. 5, 76 (2018).
- Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
- Wieser, M., et al. hTERT alone immortalizes epithelial cells of renal proximal tubules without changing their functional characteristics. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 295 (5), 1365-1375 (2008).
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortal cell lines from an H-2Kb- tsA58 transgenic mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (12), 5096-5100 (1991).
- Jat, P. S., Sharp, P. A. Cell lines established by a temperature-sensitive simian virus 40 large- T-antigen gene are growth restricted at the nonpermissive temperature. Molecular and Cellular Biology. 9 (4), 1672-1681 (1989).
- Israel, A., Kimura, A., Fournier, A., Fellous, M., Kourilsky, P. Interferon response sequence potentiates activity of an enhancer in the promoter region of a mouse H-2 gene. Nature. 322 (6081), 743-746 (1986).
- Mundel, P., et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines. Experimental Cell Research. 236 (1), 248-258 (1997).
- Ohse, T., et al. Establishment of conditionally immortalized mouse glomerular parietal epithelial cells in culture. Journal of the American Society of Nephrology. 19 (10), 1879-1890 (2008).
- Rops, A. L., et al. Isolation and characterization of conditionally immortalized mouse glomerular endothelial cell lines. Kidney International. 66 (6), 2193-2201 (2004).
- Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics. Genesis. 50 (11), 833-843 (2012).
- Archer, S. L. Mitochondrial dynamics–Mitochondrial fission and fusion in human diseases. The New England Journal of Medicine. 369 (23), 2236-2251 (2013).
- Casalena, G. A., et al. The diabetic microenvironment causes mitochondrial oxidative stress in glomerular endothelial cells and pathological crosstalk with podocytes. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 105 (2020).
- Qi, H., et al. Glomerular endothelial mitochondrial dysfunction is essential and characteristic of diabetic kidney disease susceptibility. Diabetes. 66 (3), 763-778 (2017).
- Akis, N., Madaio, M. P. Isolation, culture, and characterization of endothelial cells from mouse glomeruli. Kidney International. 65 (6), 2223-2227 (2004).
- Schuler, M. H., et al. Miro1-mediated mitochondrial positioning shapes intracellular energy gradients required for cell migration. Molecular Biology of the Cell. 28 (16), 2159-2169 (2017).
- Tang, C., et al. Mitochondrial quality control in kidney injury and repair. Nature Reviews. Nephrology. 17 (5), 299-318 (2020).
- Daniel, R., Mengeta, A., Bilodeau, P., Lee, J. M. Mitochondria tether to Focal Adhesions during cell migration and regulate their size. bioRxiv. , 827998 (2019).
- Dylewski, J. F., et al. Isolation, purification, and conditional immortalization of murine glomerular endothelial cells of microvascular phenotype. MethodsX. 7, 101048 (2020).
- Drexler, H. G., Uphoff, C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention. Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).
