Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Maus-Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrien
Summary
Der Artikel beschreibt die Methode zur Isolierung bedingt immortalisierter glomerulärer Endothelzellen aus den Nieren transgener Mäuse, die das thermolabile Affenvirus 40 exprimieren, und photoaktivierbaren Mitochondrien, PhAMexcised. Wir beschreiben das Verfahren zur Glomeruli-Isolierung aus ganzen Nieren mittels Perlen, Verdauungsschritten, Aussaat und Kultivierung von GECs-CD31-positiv.
Abstract
Eine Dysfunktion der glomerulären Endothelzelle (GEC) kann den Abbau der glomerulären Filtrationsbarriere initiieren und dazu beitragen. Erhöhter mitochondrialer oxidativer Stress wurde als ein Mechanismus vorgeschlagen, der zu einer GEC-Dysfunktion in der Pathogenese einiger glomerulärer Erkrankungen führt. In der Vergangenheit war die Isolierung von GECs aus In-vivo-Modellen aufgrund von Schwierigkeiten bei der Isolierung reiner Kulturen aus Glomeruli eine notorische Herausforderung. GECs haben komplexe Wachstumsanforderungen in vitro und eine sehr begrenzte Lebensdauer. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung und Kultivierung bedingt immortalisierter GECs mit fluoreszierenden Mitochondrien, die die Verfolgung von mitochondrialen Spaltungs- und Fusionsereignissen ermöglichen. GECs wurden aus den Nieren einer doppelten transgenen Maus isoliert, die das thermolabile SV40 TAg (aus der Immortomaus) exprimierte, was die Proliferation bedingt förderte und die Zelldifferenzierung unterdrückte, und einem photokonvertierbaren fluoreszierenden Protein (Dendra2) in allen Mitochondrien (aus der photoaktivierbaren Mitochondrien [PhAMexcised] Maus). Die erzeugte stabile Zelllinie ermöglicht eine Zelldifferenzierung nach Inaktivierung des immortalisierenden SV40 TAg-Gens und Photoaktivierung einer Untergruppe von Mitochondrien, was zu einem Wechsel der Fluoreszenz von Grün zu Rot führt. Die Verwendung von mitoDendra2-GECs ermöglicht die Live-Bildgebung der Verteilung, Fusion und Spaltung fluoreszierender Mitochondrien, ohne die Zellen zu färben.
Introduction
Der Glomerulus ist entscheidend für die Blutfiltration, indem er den Durchgang großer Moleküle durch die glomeruläre Filtrationsbarriere 1,2 einschränkt. Der Glomerulus enthält vier Zelltypen: parietale Epithelzellen, Podozyten (viszerale Epithelzellen), glomeruläre Endothelzellen (GEC) und mesangiale Zellen3. Das glomeruläre Endothel zeichnet sich durch eine einzigartige Gefäßstruktur aus, entsprechend dem Vorhandensein von Fenestrae, das für große Filtrationsvolumina erforderlich ist4. Die apikale Oberfläche des glomerulären Endothels ist mit einer negativ geladenen Glykokalyxschicht und einer Schicht bedeckt, die als endotheliale Oberflächenschicht bezeichnet wird und einen Raum zwischen dem Endothel und dem Blut schafft. Diese Struktur bietet eine hohe Ladungsselektivität, die den Durchgang von negativ geladenen Molekülen wie Albumin einschränkt und die Leukozyten- und Thrombozytenadhäsion verhindert5.
GECs reagieren sehr empfindlich auf metabolische Veränderungen, wie die Hyperglykämie im Zusammenhang mit dem diabetischen Milieu. Tatsächlich führt Diabetes zu einer erhöhten Zirkulation schädlicher Substanzen, zur Sättigung der Glukosestoffwechselwege und zu einem gestörten zellulären Redoxgleichgewicht 3,6. Darüber hinaus induziert die Zunahme der reaktiven Sauerstoffspezies eine mitochondriale Dysfunktion, die die Endothelfunktion beeinträchtigt7.
Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls ist es, immortalisierte glomeruläre Endothelzellen mit fluoreszierenden mitochondrialen Merkmalen zu isolieren. Tatsächlich hat die Zellkultur von primären GECs einen begrenzten proliferativen Zyklus und eine frühe Seneszenz8. Darüber hinaus hilft das Vorhandensein von fluoreszierenden Mitochondrien, Spalt- und Fusionsereignisse als Reaktion auf Hyperglykämie oder eine andere Behandlung zu untersuchen. Als alternative Methode verwendeten andere Labore h-TERT, um Zellen in vitro9 zu verewigen.
Die hier beschriebene Methode ermöglicht die Isolierung von bedingt immortalisierten mitoDendra2 glomerulären Endothelzellen aus 4-6 Wochen alten Tieren (Abbildung 1). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Verwendung transgener Mäuse (H-2K b-tsA58), die das Simian Virus 40 Large Tumor Antigen (SV40 TAg) Gen10,11 zur Erzeugung thermolabiler bedingt immortalisierter Zellen beherbergen. Das TSA58 TAg-Genprodukt ist bei der permissiven Temperatur von 33 °C unter der Kontrolle des induzierbaren 5′-flankierenden Promotors des Maus-H-2K-b-Gens funktionsfähig, der bei Exposition gegenüber Interferon gamma (IFNγ) über das Basalniveau erhöht ist, wodurch der bedingte Proliferationsphänotyp12 erhalten bleibt. H-2Kb wird bei der nicht-permissiven Temperatur von 37 °C in Abwesenheit von IFNγ schnell abgebaut, wodurch die immortalisierende Funktion des tsA58Tag in Zellen entfernt wird und die Zellen einen differenzierteren Phänotyp13,14,15 entwickeln können. Die optionale Kreuzung von H-2Kb-tsA58 transgenen Mäusen mit PhAM-Mäusen, die ein mitochondrienspezifisches (Untereinheit VIII der Cytochrom-c-Oxidase) Dendra2-grün exprimieren, ermöglicht den Live-Nachweis fluoreszierender Mitochondrien16. Die grüne Dendra2-Fluoreszenz schaltet nach Bestrahlung mit einem 405-nm-Laser16 auf rote Fluoreszenz um. Wenn Mitochondrien nach dem Photoswitching verschmelzen, bilden sie längliche Formen, die durch den Austausch von grünem und gelbem Material gelb erscheinen oder rot erscheinen, wenn sie einer Spaltung unterzogenwerden 7,17. Die mitoDendra2-GECs sind ein großartiges Werkzeug, um die zellulären Reaktionen von GEC-Mitochondrien auf verschiedene Reize zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mitochondrien sind entscheidend für den Zellstoffwechsel, die Homöostase und Stressreaktionen, und ihre Dysfunktion ist mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich Nierenerkrankungen. Mitochondrien spielen eine Rolle bei der pathologischen Erzeugung übermäßiger reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Regulation des intrazellulären Kalziumspiegels, der Zelltodwege und der Dynamik des Zytoskeletts21,22,23.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Professor Cijiang He und Dr. Fu Jia für ihre Einblicke in die Endothelzellisolierung von Mäusen und danken Professor Mone Zaidi für die Bereitstellung der von PhAMausgeschnittenen Mäuse und wertvolle Diskussionen. Die Autoren möchten auch dem Microscopy CORE an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai und den Mitarbeitern für die Beratung danken, die wir erhalten haben. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institutes of Health Grant R01DK097253 und des Department of Defense CDMRP Grant E01 W81XWH2010836 an I.S.D. unterstützt.
Materials
| 100 µm cell strainer | Fisher | 22-363-549 | |
| 1ml Insulin Syringes | BD | 329424 | |
| 25G butterfly | BD | 367298 | |
| 3 mm cutting edge scissors | F.S.T | 15000-00 | |
| 30ml syringe | BD Biooscience | 309650 | |
| 40 µm cell strainer | Fisher | 22-363-547 | |
| 40 µm nylon mesh | |||
| Bonn Scissors | F.S.T | 14184-09 | |
| Bovine serum albumin | Fisher | BP1600-100 | |
| CD31 | abcam | ab7388 | |
| Collagenase type I | Corning | 354236 | |
| Collagenase type II | SIGMA | C6885 | 125CDU/mg |
| Collagene type IV | SIGMA | C5533-5M | |
| Dnase-I | Qiagen | 79254 | |
| Dynabeads 450 | Thermofisher Scientific | 14013 | |
| endothelial cells growth medium | Lonza | cc-3156 | |
| Extra fine graefe forceps | F.S.T | 11150-10 | |
| FBS | Gemini | 100-106 | Heat inactivated |
| Fibronectin | Thermofisher | 33016015 | |
| Fine forceps | F.S.T Dumont | E6511 | |
| HBSS | GIBCO | 14065-056 | |
| IFNg | Cell Science | CRI001B | |
| Immortomouse | Jackson laboratory | 32619 | Tg(H2-K1-tsA58)6Kio/LicrmJ |
| L-Glutamine 100x | Thermofisher Scientific | 25030081 | |
| Magnetic particle concentrator | Thermofisher Scientific | 12320D | |
| mitotracker | Thermofisher Scientific | M7512 | |
| PBS 1X | Corning | 46-013-CM | |
| penecillin streptomycin 100x | Thermofisher Scientific | 10378016 | |
| PhaM mice | Jackson laboratory | 18397 | B6;129S-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-COX8A/Dendra2)Dcc/J |
| Protease (10 mg/ml) | SIGMA | P6911 | |
| RPMI | GIBCO | 3945 | |
| Sodium Pyruvate 100mM | Thermofisher Scientific | 11360070 | |
| Standard pattern forceps | F.S.T | 11000-12 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | F.S.T | 14008-14 | |
| synaptopodin | Santa Cruz | sc-515842 | |
| Trypsin 0.05% | Thermofisher Scientific | 25300054 |
References
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