Svin levertransplantasjon uten venøs bypass som et utvidet kriterium donormodell

Summary

I denne protokollen beskrives en modell av svin ortotopisk levertransplantasjon etter statisk kald lagring av donororganer i 20 timer uten bruk av venøs bypass under engraftment. Tilnærmingen bruker en forenklet kirurgisk teknikk med minimering av den anhepatiske fasen og sofistikert volum og vasopressorstyring.

Abstract

Levertransplantasjon regnes som gullstandarden for behandling av en rekke dødelige leversykdommer. Uløste problemer med kronisk transplantatsvikt, pågående organdonormangel og økt bruk av marginale transplantater krever imidlertid forbedring av dagens konsepter, for eksempel implementering av organmaskinperfusjon. For å evaluere nye metoder for transplantatrekondisjonering og modulering, er det nødvendig med translasjonsmodeller. Med hensyn til anatomiske og fysiologiske likheter med mennesker og nyere fremskritt innen xenotransplantasjon, har griser blitt den viktigste store dyrearten som brukes i transplantasjonsmodeller. Etter den første introduksjonen av en ortotopisk levertransplantasjonsmodell av Garnier og medarbeidere i 1965, har flere modifikasjoner blitt publisert de siste 60 årene.

På grunn av spesifiseringsspesifikke anatomiske egenskaper anses en veno-venøs bypass i den anhepatiske fasen som en nødvendighet for å redusere tarmbelastning og iskemi som resulterer i hemodynamisk ustabilitet og perioperativ dødelighet. Implementeringen av en bypass øker imidlertid prosedyrens tekniske og logistiske kompleksitet. Videre har tilknyttede komplikasjoner som luftemboli, blødning og behovet for samtidig splenektomi blitt rapportert tidligere.

I denne protokollen beskriver vi en modell for ortotopisk levertransplantasjon av svin uten bruk av venøs veno-bypass. Transplantatet av donorlever etter statisk kjølelagring på 20 timer – simulering av donorbetingelser med utvidede kriterier – viser at denne forenklede tilnærmingen kan utføres uten signifikante hemodynamiske endringer eller intraoperativ mortalitet og med regelmessig opptak av leverfunksjon (som definert ved galleproduksjon og leverspesifikk CYP1A2-metabolisme). Suksessen til denne tilnærmingen sikres av en optimalisert kirurgisk teknikk og en sofistikert anestesiologisk volum og vasopressorstyring.

Denne modellen bør være av spesiell interesse for arbeidsgrupper som fokuserer på det umiddelbare postoperative forløpet, iskemi-reperfusjonsskade, tilhørende immunologiske mekanismer og rekondisjonering av donororganer med utvidede kriterier.

Introduction

Levertransplantasjon gjenstår å være den eneste sjansen for overlevelse i en rekke forskjellige sykdommer som fører til akutt eller kronisk leversvikt. Siden den første vellykkede applikasjonen i menneskeheten i 1963 av Thomas E. Starzl, har begrepet levertransplantasjon utviklet seg til et pålitelig behandlingsalternativ som brukes over hele verden, hovedsakelig som et resultat av fremskritt i forståelsen av immunsystemet, utviklingen av moderne immunosuppresjon og optimalisering av perioperativ omsorg og kirurgiske teknikker ^1,2 . Aldrende befolkninger og økt etterspørsel etter organer har imidlertid resultert i mangel på donorer, med økt bruk av marginale transplantater fra donorer med utvidede kriterier og fremveksten av nye utfordringer de siste tiårene. Innføringen og den utbredte implementeringen av organmaskinperfusjon antas å åpne for en rekke muligheter med hensyn til transplantatrekondisjonering og modulering og bidra til å redusere organmangel og redusere ventelistedødeligheten 3,4,5,6.

For å evaluere disse konseptene og deres effekter in vivo, er translasjonstransplantasjonsmodeller nødvendige⁷. I 1983 introduserte Kamada og medarbeidere en effektiv ortotopisk levertransplantasjonsmodell hos rotter som siden har blitt omfattende modifisert og anvendt av arbeidsgrupper over hele verden 8,9,10,11. Den ortotopiske levertransplantasjonsmodellen hos mus er teknisk mer krevende, men også mer verdifull når det gjelder immunologisk overførbarhet, og ble først rapportert i 1991 av Qian et ^al.12. Til tross for fordeler med hensyn til tilgjengelighet, dyrevelferd og kostnader, er gnagermodeller begrenset i anvendelighet i kliniske omgivelser⁷. Derfor er det nødvendig med store dyremodeller.

I de senere år har griser blitt den viktigste dyrearten som brukes til translasjonsforskning på grunn av deres anatomiske og fysiologiske likheter med mennesker. Videre kan nåværende fremgang innen xenotransplantasjon ytterligere øke betydningen av griser som forskningsobjekter^13,14.

Garnier og medarbeidere beskrev en levertransplantasjonsmodell hos griser allerede i 1965¹⁵. Flere forfattere, inkludert Calne et al i 1967 og Chalstrey et al i 1971, rapporterte senere modifikasjoner, noe som til slutt førte til et trygt og gjennomførbart konsept for eksperimentell svinlevertransplantasjon i tiårene som fulgte 16,17,18,19,20,21.

Mer nylig har ulike arbeidsgrupper gitt data med hensyn til aktuelle problemstillinger ved levertransplantasjon ved hjelp av en teknikk for svin ortotopisk levertransplantasjon, nesten alltid inkludert en aktiv eller passiv veno-venøs, dvs. porto-caval, bypass^19,22. Årsaken til dette er en artsspesifikk intoleranse mot klemming av vena cava inferior og portalvenen i den anhepatiske fasen på grunn av en relativt større tarm og færre porto-caval eller cavo-caval shunts (f.eks. Mangel på vena azygos), noe som resulterer i økt perioperativ sykelighet og dødelighet²³. Vena cava dårligere sparsomme transplantasjonsteknikker anvendt hos humane mottakere som et alternativ er ikke gjennomførbare da svin vena cava inferior er innkapslet av levervev²³.

Imidlertid øker bruken av en venøs bypass ytterligere teknisk og logistisk kompleksitet i en allerede krevende kirurgisk prosedyre, og forhindrer derfor muligens arbeidsgrupper i å forsøke å implementere modellen helt. Bortsett fra de direkte fysiologiske og immunologiske effektene av en bypass, har noen forfattere påpekt den betydelige sykeligheten som blodtap eller luftemboli under shuntplassering og behovet for samtidig splenektomi, som potensielt påvirker kort- og langsiktige resultater etter engraftment^24,25.

Følgende protokoll beskriver en enkel teknikk for ortotopisk levertransplantasjon av svin etter statisk kald lagring av donororganer i 20 timer, som representerer utvidede kriterier donorforhold uten bruk av veno-venøs bypass under engraftment, inkludert donorleverinnkjøp, forberedelse av bakbord, mottaker hepatektomi og anestesiologisk pre- og intraoperativ behandling.

Denne modellen bør være av spesiell interesse for kirurgiske arbeidsgrupper med fokus på umiddelbart postoperativt forløp, iskemi-reperfusjonsskade, rekondisjonering av donororganer med utvidede kriterier og tilhørende immunologiske mekanismer.

Protocol

Denne studien ble utført ved laboratoriet for dyrevitenskap ved Hannover Medical School etter godkjenning av Niedersachsens regionale myndighet for forbrukerbeskyttelse og mattrygghet (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146) 1. Anskaffelse av donorlever MERK: Leverdonorene var tamgriser (Sus scrofa domesticus), i alderen 4-5 måneder og med en gjennomsnittlig kroppsvekt på ca. 50 kg, …

Representative Results

Teknikken som presenteres i denne protokollen har gitt pålitelige og reproduserbare resultater når det gjelder hemodynamisk stabilitet og dyreoverlevelse gjennom hele prosedyren, samt transplantatfunksjon i det postoperative forløpet. Nylig brukte vi modellen for studier av iskemi-reperfusjonsskade og terapeutiske tiltak som dempende skadelige effekter i det umiddelbare postoperative forløpet. Ved uthenting og 20 timer statisk kjølelagring ble levertransplantater (med en middelvekt på 98…

Discussion

Nylige tekniske utviklinger som innføring av maskinperfusjon har potensial til å revolusjonere feltet levertransplantasjon. For å oversette transplantatrekondisjonerings- eller modifikasjonskonsepter til kliniske omgivelser, er reproduserbare transplantasjonsmodeller hos store dyr uunngåelige.

Etter den første introduksjonen av ortotopisk levertransplantasjon hos svin har flere forfattere jobbet med forbedring av disse teknikkene de siste fem tiårene. Forskjeller innenfor de rapporterte …

Materials

Abdominal retractor	No Company Name available	No Catalog Number available
Aortic clamp, straight	Firma Martin	No Catalog Number available
Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL	Radiometer Medical ApS	956-622
Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL)	B.Braun	648037
Backhaus clamp	Bernshausen	BF432
Bipolar forceps, 23 cm	SUTTER	780222 SG
Bowl 5 L, 6 L, 9 L	Chiru-Instrumente	35-114327
Braunol Braunoderm	B.Braun	3881059
Bulldog clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Button canula	Krauth + Timmermann GmbH	1464LL1B
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%))	B.Braun	2353745
Cell Saver (Autotransfusion Reservoir)	Fresenius Kabi AG	9108471
Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm	Arrow	AD-24703
Clamp	INOX	B-17845  /  BH110  / B-481
Clamp	Aesculap	AN909R
Clamp, 260 mm	Fehling Instruments GMbH &Co.KG	ZAU-2
Clip Forceps, medium	Ethicon	LC207
Clip forceps, small	Ethicon	LC107
CPDA-1 solution	Fresenius Kabi AG	41SD09AA00
Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution)	Dr.Franz Köhler Chemie GmbH	2125921
Dissecting scissors	LAWTON  05-0641	No Catalog Number available
Dissecting scissors, 180 mm	Metzenbaum	BC606R
Endotracheal tube 8.0 mm	Covetrus	800764
Epinephrine (Adrenalin 1:1000)	InfectoPharm	9508734
Falcon Tubes 50ml	Greiner	227 261 L
Femoralis clamp	Ulrich	No Catalog Number available
Fentanyl 0.1mg	PanPharma	00483
Forceps, anatomical	Martin	12-100-20
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD052R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD032R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD240R
Forceps, surgical	Bernshausen	BD 671
Forceps, surgical	INOX	B-1357
G40 solution	Serag Wiessner	10755AAF
Gelafundin ISO solution 40 mg/mL	B. Braun	210257641
Guidewire with marker	Arrow	14F21E0236
Haemostatic gauze ("Tabotamp"  5 x 7.5 cm)	Ethicon	474273
Heparin sodium 25,000IE	Ratiopharm	W08208A
Hico-Aquatherm 60	Hospitalwerk	No Catalog Number available
Infusion Set Intrafix	B.Braun	4062981 L
Intrafix SafeSet 180 cm	B.Braun	4063000
Introcan Safety, 18 G	B.Braun	4251679-01
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-bore venous catheter, 7Fr.	Edwards Lifesciences	I301F7
Ligaclip, medium	Ethicon	LT200
Ligaclip, small	Ethicon	LT100
Material scissors	Martin	11-285-23
Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg)	Sanofi	7823704
Monopolar ERBE ICC 300	Fa. Erbe	No Catalog Number available
NaCl solution (0.9%)	Baxter	1533
Needle holder	Aesculap	BM36
Needle holder	Aesculap	BM035R
Needle holder	Aesculap	BM 67
Neutral electrode	Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen	21191 – 060
Norepinephrine (Sinora)	Sintetica GmbH	04150124745717
Omniflush Sterile Filed 10 mL	B.Braun	3133335
Original Perfusorline 300 cm	B.Braun	21E26E8SM3
Overhold clamp	INOX	BH 959
Overhold clamp	Ulrich	CL 2911
Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL)	WDT, Garbsen	21217
Perfusers	B.Braun	49-020-031
Perfusor Syringe 50 mL	B.Braun	8728810F
Petri dishes  92 x 17 mm	Nunc	150350
Poole Suction Instrument Argyle flexibel	Covidien, Mansfield USA	20C150FHX
Potassium chloride (7.45%)	B.Braun	4030539078276
Pressure measurement set	Codan pvb Medical GmbH	957179
Propofol (1%)	CP-Pharma	No Catalog Number available
S-Monovette 2.6 mL K3E	Sarstedt	04.1901
S-Monovette 2.9 mL 9NC	Sarstedt	04.1902
S-Monovette 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	11602
Sartinski clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Scalpel  No.11	Feather Safety Razor Co.LTD	02.001.40.011
Scissors	INOX	BC 746
Seldinger Arterial catheter	Arrow	SAC-00520
Sodium bicarbonate (8.4%)	B.Braun	212768082
Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC")	B.Braun	4899719
Sterofundin ISO solution	B.Braun	No Catalog Number available
Suction	Dahlhausen	07.068.25.301
Suction Aesculap Securat 80	Aesculap	No Catalog Number available
Suction catheter	ConvaTec	5365049
Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam)	Pfizer	DL253102
Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm	ConvaTec	UK  1F02772
Suprasorb ("Toptex lite RK")	Lohmann & Rauscher	31654
Suture Vicryl 3-0	Ethicon	VCP 1218 H
Suture Vicryl 4-0	Ethicon	V392H
Suture, Prolene 4-0	Ethicon	7588 H
Suture, Prolene 5-0, double armed	Ethicon	8890 H
Suture, Prolene 5-0, single armed	Ethicon	8720 H
Suture, Prolene 6-0, double armed	Ethicon	7230 H
Suture, Prolene 6-0, single armed	Ethicon	EH 7406 H
Suture, Prolene: blau 3-0	Ethicon	EH 7499H
Suture, Safil 2/0	Aesculap	C 1038446
Suture, Terylene 0	Serag Wiessner	353784
Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL	B.Braun	4606027V
TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm	Fresenius Kabi AG	2877101
Ultrasound Butterfly IQ+	Butterfly Network Inc.	850-20014
Ventilator "Oxylog Dräger Fl"	Dräger Medical AG	No Catalog Number available
Yankauer Suction	Medline	RA19GMD
Zoletil 100 mg/mL  (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin)	Virbac	794-861794861