Transplante de fígado suíno sem bypass venovenoso como um modelo de doador de critérios estendidos

Summary

Neste protocolo, descreve-se um modelo de transplante hepático ortotópico suíno após armazenamento a frio estático de órgãos doadores por 20 h sem o uso de bypass venovenoso durante o enxerto. A abordagem utiliza uma técnica cirúrgica simplificada com minimização da fase anhepática e manejo sofisticado do volume e vasopressor.

Abstract

O transplante de fígado é considerado o padrão-ouro para o tratamento de uma variedade de doenças hepáticas fatais. No entanto, questões não resolvidas de insuficiência crônica do enxerto, escassez contínua de doadores de órgãos e o aumento do uso de enxertos marginais exigem a melhoria dos conceitos atuais, como a implementação da perfusão de máquinas de órgãos. Para avaliar novos métodos de recondicionamento e modulação do enxerto, são necessários modelos translacionais. No que diz respeito às semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos e aos recentes progressos no campo do xenotransplante, os porcos tornaram-se a principal espécie animal de grande porte usada em modelos de transplante. Após a introdução inicial de um modelo de transplante de fígado ortotópico suíno por Garnier et al. em 1965, várias modificações foram publicadas nos últimos 60 anos.

Devido a características anatômicas específicas de especificações, um bypass venovenoso durante a fase anhepática é considerado uma necessidade para reduzir a congestão intestinal e a isquemia, resultando em instabilidade hemodinâmica e mortalidade perioperatória. No entanto, a implementação de um desvio aumenta a complexidade técnica e logística do procedimento. Além disso, complicações associadas, como embolia aérea, hemorragia e necessidade de esplenectomia simultânea, foram relatadas anteriormente.

Neste protocolo, descrevemos um modelo de transplante hepático ortotópico suíno sem o uso de bypass venovenoso. O enxerto de fígados de doadores após armazenamento a frio estático de 20 h – simulando condições de doador com critérios estendidos – demonstra que essa abordagem simplificada pode ser realizada sem alterações hemodinâmicas significativas ou mortalidade intraoperatória e com captação regular da função hepática (conforme definido pela produção biliar e metabolismo hepático específico do CYP1A2). O sucesso dessa abordagem é assegurado por uma técnica cirúrgica otimizada e um sofisticado volume anestesiológico e manejo vasopressor.

Esse modelo deve ser de especial interesse para grupos de trabalho com foco no curso pós-operatório imediato, lesão de isquemia-reperfusão, mecanismos imunológicos associados e recondicionamento de órgãos doadores de critérios estendidos.

Introduction

O transplante de fígado continua a ser a única chance de sobrevivência em uma variedade de doenças diferentes que levam à insuficiência hepática aguda ou crônica. Desde sua primeira aplicação bem-sucedida na humanidade, em 1963, por Thomas E. Starzl, o conceito de transplante hepático evoluiu para uma opção de tratamento confiável aplicada em todo o mundo, principalmente como resultado dos avanços na compreensão do sistema imunológico, do desenvolvimento da imunossupressão moderna e da otimização dos cuidados perioperatórios e das técnicas cirúrgicas ^1,2 . No entanto, o envelhecimento populacional e a maior demanda por órgãos resultaram na escassez de doadores, com o aumento do uso de enxertos marginais de doadores de critérios estendidos e o surgimento de novos desafios nas últimas décadas. Acredita-se que a introdução e a implementação generalizada da perfusão de máquinas de órgãos abram um leque de possibilidades no que diz respeito ao recondicionamento e modulação do enxerto e ajudem a mitigar a escassez de órgãos e reduzir a mortalidade na lista de espera ^3,4,5,6.

Para avaliar esses conceitos e seus efeitos in vivo, são necessários modelos de transplante translacional⁷. Em 1983, Kamada et al. introduziram um modelo eficiente de transplante ortotópico de fígado em ratos que desde então tem sido extensivamente modificado e aplicado por grupos de trabalho em todo o mundo 8,9,10,11. O modelo de transplante hepático ortotópico em camundongos é tecnicamente mais exigente, mas também mais valioso em termos de transferibilidade imunológica, e foi relatado pela primeira vez em 1991 por Qian et ^al.12. Apesar das vantagens em relação à disponibilidade, bem-estar animal e custos, os modelos de roedores são limitados em sua aplicabilidade em ambientes clínicos⁷. Por isso, são necessários modelos animais de grande porte.

Nos últimos anos, os porcos tornaram-se a principal espécie animal usada para pesquisa translacional devido às suas semelhanças anatômicas e fisiológicas com os seres humanos. Além disso, o progresso atual no campo do xenotransplante pode aumentar ainda mais a importância dos suínos como objetos de pesquisa^13,14.

Garnier et al. descreveram um modelo de transplante hepático em suínos já em 1965¹⁵. Vários autores, incluindo Calne et al., em 1967, e Chalstrey et al., em 1971, posteriormente relataram modificações, levando a um conceito seguro e viável de transplante experimental de fígado suíno nas décadas seguintes 16,17,18,19,20,21.

Mais recentemente, diferentes grupos de trabalho têm fornecido dados sobre questões atuais no transplante hepático utilizando uma técnica de transplante hepático ortotópico suíno, quase invariavelmente incluindo um veno-venoso ativo ou passivo, ou seja, porto-caval, bypass^19,22. A razão para isso é uma intolerância específica da espécie ao pinçamento da veia cava inferior e da veia porta durante a fase anhepática devido a um intestino comparativamente maior e menos shunts porto-caval ou cavo-caval (por exemplo, falta de uma veia ázigos), resultando em aumento da morbidade e mortalidade perioperatória²³. As técnicas de transplante poupador de veia cava inferior aplicadas em receptores humanos como alternativa não são viáveis, pois a veia cava inferior suína é envolta por tecido hepático²³.

No entanto, o uso de um bypass venovenoso aumenta ainda mais a complexidade técnica e logística em um procedimento cirúrgico já exigente, possivelmente impedindo que os grupos de trabalho tentem a implementação do modelo completamente. Além dos efeitos fisiológicos e imunológicos diretos de um bypass, alguns autores têm apontado a morbidade significativa, como perda de sangue ou embolia aérea durante a colocação do shunt e a necessidade de uma esplenectomia simultânea, potencialmente afetando os resultados de curto e longo prazo após o enxerto^24,25.

O protocolo a seguir descreve uma técnica simples de transplante hepático ortotópico suíno após armazenamento a frio estático de órgãos de doadores por 20 h, representando condições de doador de critérios estendidos sem o uso de bypass venovenoso durante o enxerto, incluindo captação de fígado do doador, preparo da mesa de fundo, hepatectomia do receptor e manejo anestesiológico pré e intraoperatório.

Esse modelo deve ser de especial interesse para grupos de trabalho cirúrgicos com foco no curso pós-operatório imediato, lesão de isquemia-reperfusão, recondicionamento de órgãos doadores de critérios estendidos e mecanismos imunológicos associados.

Protocol

Este estudo foi realizado no Laboratório de Zootecnia da Faculdade de Medicina de Hannover após aprovação pela autoridade regional da Baixa Saxónia para a proteção dos consumidores e a segurança alimentar (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit [LAVES]; 19/3146) 1. Colheita de fígado do doador NOTA: Os doadores de fígado eram fêmeas de porcos domésticos (Sus scrofa domesticus), com idade ent…

Representative Results

A técnica apresentada neste protocolo proporcionou resultados confiáveis e reprodutíveis em termos de estabilidade hemodinâmica e sobrevida animal ao longo do procedimento, bem como função do enxerto no pós-operatório. Mais recentemente, aplicamos o modelo para o estudo da lesão de isquemia-reperfusão e intervenções terapêuticas mitigando efeitos prejudiciais no pós-operatório imediato. Após a recuperação e 20 h de armazenamento a frio estático, enxertos hepáticos (com peso…

Discussion

Desenvolvimentos técnicos recentes, como a introdução da perfusão mecânica, têm o potencial de revolucionar o campo do transplante de fígado. A fim de traduzir os conceitos de recondicionamento ou modificação do enxerto em ambientes clínicos, modelos de transplante reprodutíveis em animais de grande porte são inevitáveis.

Após a introdução inicial do transplante hepático ortotópico suíno, vários autores têm trabalhado no aprimoramento dessas técnicas nas últimas cinco d?…

Materials

Abdominal retractor	No Company Name available	No Catalog Number available
Aortic clamp, straight	Firma Martin	No Catalog Number available
Arterial Blood Sampler Aspirator (safePICOAspirator) 1.5 mL	Radiometer Medical ApS	956-622
Atropine (Atropinsulfat 0.5 mg/1 mL)	B.Braun	648037
Backhaus clamp	Bernshausen	BF432
Bipolar forceps, 23 cm	SUTTER	780222 SG
Bowl 5 L, 6 L, 9 L	Chiru-Instrumente	35-114327
Braunol Braunoderm	B.Braun	3881059
Bulldog clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Button canula	Krauth + Timmermann GmbH	1464LL1B
Calcium gluconate (2.25 mmol/10 mL (10%))	B.Braun	2353745
Cell Saver (Autotransfusion Reservoir)	Fresenius Kabi AG	9108471
Central venous catheter 7Fr., 3 Lumina, 30 cm 0.81 mm	Arrow	AD-24703
Clamp	INOX	B-17845  /  BH110  / B-481
Clamp	Aesculap	AN909R
Clamp, 260 mm	Fehling Instruments GMbH &Co.KG	ZAU-2
Clip Forceps, medium	Ethicon	LC207
Clip forceps, small	Ethicon	LC107
CPDA-1 solution	Fresenius Kabi AG	41SD09AA00
Custodiol (Histidin-Tryptophan-Ketogluterat-Solution)	Dr.Franz Köhler Chemie GmbH	2125921
Dissecting scissors	LAWTON  05-0641	No Catalog Number available
Dissecting scissors, 180 mm	Metzenbaum	BC606R
Endotracheal tube 8.0 mm	Covetrus	800764
Epinephrine (Adrenalin 1:1000)	InfectoPharm	9508734
Falcon Tubes 50ml	Greiner	227 261 L
Femoralis clamp	Ulrich	No Catalog Number available
Fentanyl 0.1mg	PanPharma	00483
Forceps, anatomical	Martin	12-100-20
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD052R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD032R
Forceps, anatomical, 250 mm	Aesculap	BD240R
Forceps, surgical	Bernshausen	BD 671
Forceps, surgical	INOX	B-1357
G40 solution	Serag Wiessner	10755AAF
Gelafundin ISO solution 40 mg/mL	B. Braun	210257641
Guidewire with marker	Arrow	14F21E0236
Haemostatic gauze ("Tabotamp"  5 x 7.5 cm)	Ethicon	474273
Heparin sodium 25,000IE	Ratiopharm	W08208A
Hico-Aquatherm 60	Hospitalwerk	No Catalog Number available
Infusion Set Intrafix	B.Braun	4062981 L
Intrafix SafeSet 180 cm	B.Braun	4063000
Introcan Safety, 18 G	B.Braun	4251679-01
Isofluran CP	CP-Pharma	No Catalog Number available
Large-bore venous catheter, 7Fr.	Edwards Lifesciences	I301F7
Ligaclip, medium	Ethicon	LT200
Ligaclip, small	Ethicon	LT100
Material scissors	Martin	11-285-23
Methylprednisolone (Urbason solubile forte 250 mg)	Sanofi	7823704
Monopolar ERBE ICC 300	Fa. Erbe	No Catalog Number available
NaCl solution (0.9%)	Baxter	1533
Needle holder	Aesculap	BM36
Needle holder	Aesculap	BM035R
Needle holder	Aesculap	BM 67
Neutral electrode	Erbe Elektromedizin GmbH Tübingen	21191 – 060
Norepinephrine (Sinora)	Sintetica GmbH	04150124745717
Omniflush Sterile Filed 10 mL	B.Braun	3133335
Original Perfusorline 300 cm	B.Braun	21E26E8SM3
Overhold clamp	INOX	BH 959
Overhold clamp	Ulrich	CL 2911
Pentobarbital sodium(Release 500 mg/mL)	WDT, Garbsen	21217
Perfusers	B.Braun	49-020-031
Perfusor Syringe 50 mL	B.Braun	8728810F
Petri dishes  92 x 17 mm	Nunc	150350
Poole Suction Instrument Argyle flexibel	Covidien, Mansfield USA	20C150FHX
Potassium chloride (7.45%)	B.Braun	4030539078276
Pressure measurement set	Codan pvb Medical GmbH	957179
Propofol (1%)	CP-Pharma	No Catalog Number available
S-Monovette 2.6 mL K3E	Sarstedt	04.1901
S-Monovette 2.9 mL 9NC	Sarstedt	04.1902
S-Monovette 7.5 mL Z-Gel	Sarstedt	11602
Sartinski clamp	Aesculap	No Catalog Number available
Scalpel  No.11	Feather Safety Razor Co.LTD	02.001.40.011
Scissors	INOX	BC 746
Seldinger Arterial catheter	Arrow	SAC-00520
Sodium bicarbonate (8.4%)	B.Braun	212768082
Sterilization Set ("ProSet Preparation Kit CVC")	B.Braun	4899719
Sterofundin ISO solution	B.Braun	No Catalog Number available
Suction	Dahlhausen	07.068.25.301
Suction Aesculap Securat 80	Aesculap	No Catalog Number available
Suction catheter	ConvaTec	5365049
Sultamicillin (Unacid: 2000 mg Ampicillin/1000 mg Sulbactam)	Pfizer	DL253102
Suprapubic urinary catheter, "bronchialis", 50 cm	ConvaTec	UK  1F02772
Suprasorb ("Toptex lite RK")	Lohmann & Rauscher	31654
Suture Vicryl 3-0	Ethicon	VCP 1218 H
Suture Vicryl 4-0	Ethicon	V392H
Suture, Prolene 4-0	Ethicon	7588 H
Suture, Prolene 5-0, double armed	Ethicon	8890 H
Suture, Prolene 5-0, single armed	Ethicon	8720 H
Suture, Prolene 6-0, double armed	Ethicon	7230 H
Suture, Prolene 6-0, single armed	Ethicon	EH 7406 H
Suture, Prolene: blau 3-0	Ethicon	EH 7499H
Suture, Safil 2/0	Aesculap	C 1038446
Suture, Terylene 0	Serag Wiessner	353784
Syringe 2 mL, 5 mL, 10 mL, 20 mL	B.Braun	4606027V
TransferSet "1D/X-double" steril 330 cm	Fresenius Kabi AG	2877101
Ultrasound Butterfly IQ+	Butterfly Network Inc.	850-20014
Ventilator "Oxylog Dräger Fl"	Dräger Medical AG	No Catalog Number available
Yankauer Suction	Medline	RA19GMD
Zoletil 100 mg/mL  (50 mg Zolazepam, 50 mg tiletamin)	Virbac	794-861794861