In vivo Rilevamento della permeabilità vascolare nella ghiandola sottomandibolare del topo
Summary
Nel presente protocollo, la funzione di barriera endoteliale della ghiandola sottomandibolare (SMG) è stata valutata iniettando diversi traccianti fluorescenti pesati molecolari nelle vene angolari di modelli animali in vivo sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni.
Abstract
La saliva svolge un ruolo importante nella salute orale e generale. La funzione di barriera endoteliale intatta dei vasi sanguigni consente la secrezione di saliva, mentre la disfunzione della barriera endoteliale è correlata a molti disturbi secretori delle ghiandole salivari. Il presente protocollo descrive un metodo di rilevamento della permeabilità paracellulare in vivo per valutare la funzione delle giunzioni strette endoteliali (TJ) nelle ghiandole sottomandibolari di topo (SMG). In primo luogo, dextrans marcati con fluorescenza con diversi pesi molecolari (4 kDa, 40 kDa o 70 kDa) sono stati iniettati nelle vene angolari dei topi. Successivamente, l’SMG unilaterale è stato sezionato e fissato nel supporto personalizzato sotto un microscopio a scansione laser a due fotoni, quindi sono state catturate immagini per vasi sanguigni, acini e condotti. Utilizzando questo metodo, è stata monitorata la perdita dinamica in tempo reale dei traccianti di diverse dimensioni dai vasi sanguigni nei lati basali degli acini e persino attraverso gli epiteli acinosi nei dotti per valutare l’alterazione della funzione della barriera endoteliale in condizioni fisiologiche o fisiopatologiche.
Introduction
Varie ghiandole salivari producono saliva, che agisce principalmente come prima linea di difesa contro le infezioni e aiuta la digestione, svolgendo così un ruolo essenziale nella salute orale e generale1. L’afflusso di sangue è fondamentale per la secrezione delle ghiandole salivari poiché fornisce costantemente acqua, elettroliti e molecole che formano la saliva primaria. La funzione di barriera endoteliale, regolata dal complesso a giunzione stretta (TJ), limita rigorosamente e delicatamente la permeazione dei capillari, che sono altamente permeabili all’acqua, ai soluti, alle proteine e persino alle cellule che si spostano dai vasi sanguigni circolanti nei tessuti delle ghiandole salivari 2,3. Abbiamo precedentemente scoperto che l’apertura dei TJ endoteliali in risposta a uno stimolo colinergico facilita la secrezione di saliva, mentre la compromissione della funzione della barriera endoteliale è interconnessa con l’iposecrezione e l’infiltrazione linfocitaria nelle ghiandole sottomandibolari (SMG) nella sindrome di Sjögren4. Questi dati suggeriscono che il contributo della funzione di barriera endoteliale deve essere prestato sufficiente attenzione per quanto riguarda una varietà di malattie delle ghiandole salivari.
Un microscopio a scansione laser a due fotoni è un potente strumento per osservare la dinamica delle cellule nei tessuti intatti in vivo. Uno dei vantaggi di questa tecnica è che la luce nel vicino infrarosso (NIR) ha una penetrazione tissutale più profonda rispetto alla luce visibile o ultravioletta quando i campioni sono eccitati dalla NIR e non causa evidenti danni alla luce ai tessuti in condizioni appropriate 5,6. Infatti, le ghiandole salivari sono un tessuto molto omogeneo e superficiale, in cui le cellule acinose superficiali distano solo circa 30 μm dalla superficie della ghiandola 7,8. È stato dimostrato che la microscopia confocale intravitale può studiare la secrezione esocrina e il citoscheletro di actina nelle ghiandole salivari di topo vivo a risoluzione subcellulare8. La microscopia a scansione laser a due fotoni, tuttavia, non solo ha il vantaggio della microscopia confocale convenzionale, ma può anche essere utilizzata per rilevare più chiaramente tessuti e immagini più profondi. Qui, i destrani marcati con fluorescenza, che sono spesso usati come traccianti di permeabilità paracellulare e hanno il vantaggio di diverse dimensioni, possono essere utilizzati per testare la grandezza del poro TJ9. Nel presente studio, viene stabilita una tecnica di microscopia laser a scansione laser a due fotoni intravitale in tempo reale per la valutazione in situ della funzione della barriera endoteliale negli SMG di topo. Ogni fase di lavoro per il rilevamento della permeabilità vascolare in vivo nelle SMG di topo è descritta nel protocollo corrente. Ecco un esempio di rilevamento della funzione della barriera endoteliale nel modello di legatura del dotto SMG del topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il mantenimento e la regolazione della funzione della barriera endoteliale sono essenziali per l’omeostasi vascolare. Le cellule endoteliali e le loro giunzioni intercellulari svolgono un ruolo critico nel mantenimento e nel controllo dell’integrità vascolare12. La forza di taglio del flusso sanguigno, i fattori di crescita e i fattori infiammatori possono causare cambiamenti nella permeabilità vascolare e, quindi, partecipare all’insorgenza e allo sviluppo di malattie sistemiche come ipertensio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzioni 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 e 81974151) e dalla Beijing Natural Science Foundation (grant 7202082).
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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