インビボ マウス顎下腺における血管透過性検出
Summary
本プロトコールでは、顎下腺(SMG)の内皮バリア機能を、2光子レーザー走査顕微鏡下で in vivo の被験動物モデルの角静脈に異なる分子量蛍光トレーサーを注入することによって評価した。
Abstract
唾液は、口腔および全体的な健康に重要な役割を果たします。血管の無傷の内皮バリア機能は唾液分泌を可能にしますが、内皮バリア機能障害は多くの唾液腺分泌障害に関連しています。本プロトコルは、マウス顎下腺(SMG)における内皮タイトジャンクション(TJ)の機能を評価するための in vivo 傍細胞透過性検出方法を記載する。まず、分子量の異なる蛍光標識デキストラン(4 kDa、40 kDa、または70 kDa)をマウスの角静脈に注入しました。その後、片側SMGを解剖し、2光子レーザー走査型顕微鏡の下でカスタマイズされたホルダーに固定し、血管、腺房、および管の画像をキャプチャしました。この方法を利用して、血管から腺房の基底側、さらには腺房上皮を越えて管への異なるサイズのトレーサーのリアルタイムの動的漏出をモニターし、生理学的または病態生理学的条件下での内皮バリア機能の変化を評価しました。
Introduction
さまざまな唾液腺が唾液を生成し、これは主に感染症に対する防御の最前線として機能し、消化を助け、それによって口腔および全体的な健康に不可欠な役割を果たします1。血液供給は、一次唾液を形成する水、電解質、および分子を常に供給するため、唾液腺分泌に不可欠です。タイトジャンクション(TJ)複合体によって調節される内皮バリア機能は、水、溶質、タンパク質、さらには循環血管から唾液腺組織に移動する細胞に対しても高い透過性である毛細血管の透過を厳密かつ繊細に制限します2,3。我々はこれまでに、コリン作動性刺激に応答して内皮TJが開口すると唾液分泌が促進されるのに対し、シェーグレン症候群では内皮バリア機能の障害が顎下腺(SMG)の分泌低下やリンパ球浸潤と相互に関連していることを見出しました4。これらのデータは、様々な唾液腺疾患に関して内皮バリア機能の寄与に十分な注意を払う必要があることを示唆している。
2光子レーザー走査型顕微鏡は、in vivoで無傷の組織内の細胞のダイナミクスを観察するための強力なツールです。この技術の利点の1つは、標本がNIRによって励起されたときに、近赤外光(NIR)が可視光または紫外線よりも組織の浸透が深く、適切な条件下で組織に明らかな光損傷を引き起こさないことです5,6。実際、唾液腺は非常に均質で表在性の組織であり、表面の腺房細胞は腺表面からわずか約30μmしか離れていません7,8。生体内共焦点顕微鏡は、生きたマウス唾液腺における外分泌とアクチン細胞骨格を細胞内分解能で研究できることが示されています8。それにもかかわらず、2光子レーザー走査顕微鏡は、従来の共焦点顕微鏡の利点があるだけでなく、より深い組織や画像をより明確に検出するためにも使用できます。ここでは、傍細胞透過性トレーサーとして頻繁に使用され、サイズが異なるという利点を有する蛍光標識デクストランスを使用して、TJ細孔9の大きさを試験することができる。本研究では、マウスSMGの内皮バリア機能をその場で評価するために、生体内リアルタイム2光子レーザー走査顕微鏡技術を確立します。マウスSMGにおけるin vivo血管透過性検出のための各作業ステップは、現在のプロトコルに記載されている。マウスSMG管結紮モデルにおける内皮バリア機能の検出例である。
Protocol
Representative Results
Discussion
血管の恒常性維持には内皮バリア機能の維持・調節が不可欠です。内皮細胞とその細胞間接合部は、血管の完全性の維持と制御に重要な役割を果たします12。血流、成長因子、および炎症因子のせん断力は、血管透過性の変化を引き起こし、したがって、高血圧、糖尿病、および自己免疫疾患などの全身性疾患の発生および発症に関与する可能性がある13,14,15</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金31972908、81991500、81991502、81771093、81974151)および北京自然科学基金会(助成金7202082)の支援を受けました。
Materials
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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