Bu protokolde, submandibuler bezin (SMG) endotel bariyer fonksiyonu, iki fotonlu lazer taramalı mikroskop altında test hayvanı modellerinin açısal damarlarına in vivo olarak farklı moleküler ağırlıklı floresan izleyiciler enjekte edilerek değerlendirilmiştir.
Tükürük ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar. Kan damarlarının sağlam endotel bariyer fonksiyonu tükürük sekresyonunu sağlarken, endotel bariyer disfonksiyonu birçok tükürük bezi salgı bozukluğu ile ilişkilidir. Bu protokol, fare submandibuler bezlerinde (SMG) endotel sıkı kavşakların (TJ’ler) işlevini değerlendirmek için bir in vivo parasellüler geçirgenlik tespit yöntemini tanımlamaktadır. İlk olarak, farelerin açısal damarlarına farklı moleküler ağırlıklara (4 kDa, 40 kDa veya 70 kDa) sahip floresan etiketli dekstrans enjekte edildi. Daha sonra, tek taraflı SMG diseke edildi ve iki fotonlu lazer tarama mikroskobu altında özelleştirilmiş tutucuya sabitlendi ve daha sonra kan damarları, acini ve kanallar için görüntüler yakalandı. Bu yöntem kullanılarak, farklı büyüklükteki izleyicilerin kan damarlarından acini’nin bazal taraflarına ve hatta asinar epitelinin üzerinden kanallara gerçek zamanlı dinamik sızıntısı, fizyolojik veya patofizyolojik koşullar altında endotel bariyer fonksiyonunun değişimini değerlendirmek için izlendi.
Çeşitli tükürük bezleri, öncelikle enfeksiyonlara karşı ilk savunma hattı görevi gören ve sindirime yardımcı olan tükürük üretir, böylece ağız ve genel sağlıkta önemli bir rol oynar1. Kan akışı, tükürük bezi sekresyonu için çok önemlidir, çünkü sürekli olarak birincil tükürüğü oluşturan su, elektrolitler ve moleküller sağlar. Sıkı bağlantı (TJ) kompleksi tarafından düzenlenen endotel bariyer fonksiyonu, suya, çözünürlere, proteinlere ve hatta dolaşımdaki kan damarlarından tükürük bezi dokularına doğru hareket eden hücrelere oldukça geçirgen olan kılcal damarların geçirgenliğini kesin ve hassas bir şekilde sınırlar 2,3. Daha önce kolinerjik bir uyarana yanıt olarak endotel TJ’lerinin açılmasının tükürük sekresyonunu kolaylaştırdığını, oysa endotel bariyer fonksiyonunun bozulmasının Sjögren sendromunda submandibuler bezlerde (SMG’ler) hiposekresyon ve lenfositik infiltrasyon ile bağlantılı olduğunu bulmuştuk4. Bu veriler, çeşitli tükürük bezi hastalıkları ile ilgili endotel bariyer fonksiyonunun katkısına yeterince dikkat edilmesi gerektiğini göstermektedir.
İki fotonlu lazer taramalı mikroskop, bozulmamış dokudaki hücrelerin dinamiklerini in vivo olarak gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu tekniğin avantajlarından biri, yakın kızılötesi ışığın (NIR), numuneler NIR tarafından uyarıldığında görünür veya ultraviyole ışıktan daha derin doku penetrasyonuna sahip olması ve uygun koşullar altında dokularda belirgin ışık hasarına neden olmamasıdır 5,6. Gerçekten de, tükürük bezleri, yüzey asinar hücrelerinin bez yüzeyinden 7,8 ila 30 μm uzaklıkta olduğu çok homojen ve yüzeysel bir dokudur. İntravital konfokal mikroskopinin, canlı fare tükürük bezlerinde ekzokrin sekresyonu ve aktin sitoiskeletini hücrealtı çözünürlükte 8’de inceleyebileceği gösterilmiştir. Bununla birlikte, iki fotonlu lazer taramalı mikroskopi, sadece geleneksel konfokal mikroskopinin avantajına sahip olmakla kalmaz, aynı zamanda daha derin doku ve görüntüyü daha net bir şekilde tespit etmek için de kullanılabilir. Burada, sıklıkla parasellüler geçirgenlik izleyicileri olarak kullanılan ve farklı boyutlarda avantaja sahip olan floresan etiketli dekstrans, TJ gözenek9’un büyüklüğünü test etmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, fare SMG’lerinde endotel bariyer fonksiyonunun yerinde değerlendirilmesi için intravital gerçek zamanlı iki foton lazer taramalı mikroskopi tekniği oluşturulmuştur. Fare SMG’lerinde in vivo vasküler geçirgenlik tespiti için her çalışma adımı mevcut protokolde açıklanmıştır. İşte fare SMG kanal ligasyon modelinde endotel bariyer fonksiyonunu tespit etme örneği.
Endotel bariyer fonksiyonunun idamesi ve düzenlenmesi vasküler homeostaz için gereklidir. Endotel hücreleri ve bunların hücreler arası kavşakları, vasküler bütünlüğün korunmasında ve kontrol edilmesinde kritik bir rol oynamaktadır12. Kan akımının kayma kuvveti, büyüme faktörleri ve inflamatuar faktörler vasküler geçirgenlikte değişikliklere neden olabilir ve böylece hipertansiyon, diyabet ve otoimmün hastalıklar gibi sistemik hastalıkların ortaya çıkmasına ve ge…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibeler 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 ve 81974151) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (hibe 7202082) tarafından desteklenmiştir.
2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
Depilatory cream | Veet | ||
Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
Image J software | National Institutes of Health | ||
Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |