Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल में, सबमैंडिबुलर ग्रंथि (एसएमजी) के एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन का मूल्यांकन दो-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत विवो में परीक्षण पशु मॉडल की कोणीय नसों में विभिन्न आणविक भारित फ्लोरोसेंट ट्रेसर इंजेक्ट करके किया गया था।
Abstract
लार मौखिक और समग्र स्वास्थ्य में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। रक्त वाहिकाओं का बरकरार एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन लार स्राव को सक्षम बनाता है, जबकि एंडोथेलियल बैरियर डिसफंक्शन कई लार ग्रंथि स्रावी विकारों से संबंधित है। वर्तमान प्रोटोकॉल माउस सबमैंडिबुलर ग्रंथियों (एसएमजी) में एंडोथेलियल टाइट जंक्शनों (टीजेएस) के कार्य का मूल्यांकन करने के लिए एक इन विवो पैरासेल्युलर पारगम्यता पहचान विधि का वर्णन करता है। सबसे पहले, विभिन्न आणविक भार (4 केडीए, 40 केडीए, या 70 केडीए) के साथ प्रतिदीप्ति-लेबल डेक्सट्रांस को चूहों के कोणीय नसों में इंजेक्ट किया गया था। बाद में, एकतरफा एसएमजी को दो-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप के तहत अनुकूलित धारक में विच्छेदित और तय किया गया था, और फिर रक्त वाहिकाओं, एसिनी और नलिकाओं के लिए छवियां कैप्चर की गईं। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, शारीरिक या पैथोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए रक्त वाहिकाओं से एसिनी के बेसल किनारों में और यहां तक कि एसिनार एपिथेलिया में नलिकाओं में विभिन्न आकार के ट्रेसर के वास्तविक समय के गतिशील रिसाव की निगरानी की गई थी।
Introduction
विभिन्न लार ग्रंथियां लार का उत्पादन करती हैं, जो मुख्य रूप से संक्रमण के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में कार्य करती हैं और पाचन में मदद करती हैं, जिससे मौखिक और समग्र स्वास्थ्य में एक आवश्यक भूमिका निभाईजाती है। लार ग्रंथि स्राव के लिए रक्त की आपूर्ति महत्वपूर्ण है क्योंकि यह लगातार पानी, इलेक्ट्रोलाइट्स और अणु प्रदान करता है जो प्राथमिक लार बनाते हैं। एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन, तंग जंक्शन (टीजे) कॉम्प्लेक्स द्वारा विनियमित, सख्ती से और नाजुक रूप से केशिकाओं के पारगम्यता को सीमित करता है, जो पानी, विलेय, प्रोटीन और यहां तक कि कोशिकाओं के लिए अत्यधिक पारगम्य हैं जो परिसंचारी रक्त वाहिकाओं से लार ग्रंथि ऊतकों में चले जाते हैं। हमने पहले पाया है कि कोलीनर्जिक उत्तेजना के जवाब में एंडोथेलियल टीजेएस का उद्घाटन लार स्राव की सुविधा प्रदान करता है, जबकि एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन की हानि स्जोग्रेन सिंड्रोम4 में सबमैंडिबुलर ग्रंथियों (एसएमजी) में हाइपोस्राव और लिम्फोसाइटिक घुसपैठ के साथ जुड़ी हुई है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के योगदान को विभिन्न प्रकार के लार ग्रंथि रोगों के बारे में पर्याप्त ध्यान देने की आवश्यकता है।
एक दो-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोप विवो में बरकरार ऊतक में कोशिकाओं की गतिशीलता को देखने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस तकनीक के फायदों में से एक यह है कि निकट-अवरक्त प्रकाश (एनआईआर) में दृश्यमान या पराबैंगनी प्रकाश की तुलना में गहरा ऊतक प्रवेश होता है जब नमूने एनआईआर द्वारा उत्तेजित होते हैं और उपयुक्त परिस्थितियोंमें ऊतकों को स्पष्ट प्रकाश क्षति नहीं पहुंचाते हैं। दरअसल, लार ग्रंथियां एक बहुत ही समरूप और सतही ऊतक हैं, जिसमें सतह एसिनार कोशिकाएं ग्रंथि की सतह 7,8 से केवल 30 μm दूर हैं। यह दिखाया गया है कि इंट्रावाइटल कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी उपकोशिकीय संकल्प8 पर जीवित माउस लार ग्रंथियों में एक्सोक्राइन स्राव और एक्टिन साइटोस्केलेटन का अध्ययन कर सकती है। दो-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी, फिर भी, न केवल पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का लाभ है, बल्कि इसका उपयोग गहरे ऊतक और छवि का अधिक स्पष्ट रूप से पता लगाने के लिए भी किया जा सकता है। यहां, प्रतिदीप्ति-लेबल डेक्सट्रांस, जो अक्सर पैरासेलुलर पारगम्यता ट्रेसर के रूप में उपयोग किया जाता है और विभिन्न आकारों का लाभ होता है, का उपयोग टीजे पोर9 के परिमाण का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन में, माउस एसएमजी में एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन के सीटू मूल्यांकन के लिए एक इंट्रावाइटल रियल-टाइम टू-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी तकनीक स्थापित की गई है। माउस एसएमजी में विवो संवहनी पारगम्यता का पता लगाने के लिए प्रत्येक कार्य चरण वर्तमान प्रोटोकॉल में वर्णित है। यहां माउस एसएमजी डक्ट लिगेशन मॉडल में एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन का पता लगाने का एक उदाहरण है।
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Protocol
सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को पशु अनुसंधान की आचार समिति, पेकिंग विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया था, और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड (एनआईएच प्रकाशन संख्या 85-23, संशोधित 1996) का अनुपालन किया गया था। वर्तमान अध्ययन के लिए 8-10 सप्ताह के आयु वर्ग में नर जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) चूहों का उपयोग किया गया था। प्रयोगात्मक जानवरों को उनके दर्द और असुविधा को कम करने के लिए सावधानीपूर्वक इलाज किया गया था।
1. पशु प्रक्रियाएं
- एनेस्थेटिक्स और ट्रेसर तैयार करें और प्रशासित करें।
- पूरे अध्ययन में बाँझ स्थितियों को बनाए रखें और ऑटोक्लेविंग द्वारा उपकरणों को निष्फल करें। चूहों को दो समूहों में विभाजित करें।
नोट: नियंत्रण समूह को अनुपचारित छोड़ दिया गया था, और 1 दिन के लिए एकतरफा एसएमजी डक्ट लिगेशन वाले दूसरे समूह ने प्रयोगात्मक समूह के रूप में कार्य किया। समूहीकरण करते समय, संवहनी पारगम्यता पर वजन और उम्र के प्रभाव को कम करने के लिए समान शरीर के वजन और उम्र वाले चूहों का चयन करने की आवश्यकता होती है। - उचित ट्रेसर चुनें जैसे फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) -लेबल डेक्सट्रान (आणविक भार: 4 केडीए; एफडी 4) और रोडामाइन बी-लेबल डेक्सट्रान (आणविक भार: 70 केडीए; पारगम्यता परख के लिए प्रतिदीप्ति संकेतों (क्रमशः एफआईटीसी या रोडामाइन बी फिल्टर का उपयोग करके) के बीच हस्तक्षेप को कम करने के लिए अलग-अलग उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ आरडी 70) ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: एफडी 4 और आरडी 70 की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य क्रमशः 488 एनएम और 594 एनएम हैं, और चयनित उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य क्रमशः 511-564 एनएम और 617-669 एनएम हैं। - बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सलाइन (1x PBS) में ट्रेसर को 100 mg/mL स्टॉक में पतला करें और -20 °C पर प्रकाश से सुरक्षित एलिकोट को स्टोर करें।
नोट: 4 केडीए जैसे आणविक भार के साथ डेक्सट्रानपैथोलॉजिकल स्थितियों के बिना भी माउस एसएमजी में रक्त से तेजी से रिसाव करेगा। - चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए इंट्रापरिटोनियल रूप से ट्राइब्रोमोएथेनॉल (25 ग्राम माउस के लिए खुराक लगभग 600 μL थी) इंजेक्ट करती है। स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुशंसित एनाल्जेसिया प्रदान करें।
नोट: संज्ञाहरण के प्रेरण के बाद, सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का उपयोग करें। 11 जानवरों की अच्छी देखभाल करें। तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि माउस यांत्रिक उत्तेजना को सहन नहीं करता है जैसे कि मोटर प्रतिक्रिया के बिना पैर की अंगुली चुटकी। - कोणीय नस (0.5 मिलीग्राम / जी शरीर के वजन) में विभिन्न आणविक भार (एफडी 4 और आरडी 70) के साथ दो पैरासेल्युलर पारगम्यता ट्रेसर के मिश्रण को इंजेक्ट करें। प्रत्येक माउस को 100 μL ट्रेसर समाधान मिश्रण के साथ इंजेक्ट करें, जिसमें प्रत्येक डाई के 50 μL को 1: 1 अनुपात में मिश्रित किया जाता है।
- संज्ञाहरण के बाद, धीरे से माउस के सिर और गर्दन को पकड़ें ताकि नेत्रगोलक का एक तरफ थोड़ा सा फैल जाए। आंख के सही कोण पर आंख के कोने के साथ फ्लोरोसेंट ट्रेसर युक्त इंसुलिन सिरिंज डालें (सावधान रहें कि सिरिंज में कोई हवा पेश न करें)।
नोट: यदि कोणीय नस सही ढंग से डाली गई है, तो डाई समाधान आसानी से नस में इंजेक्ट किया जाएगा, और इंजेक्शन के दौरान कोई प्रतिरोध नहीं होगा। इसके अतिरिक्त, चूहों में पूंछ की नस इंजेक्शन अंतःशिरा ट्रेसर अणुओं के लिए एक उम्मीदवार भी हो सकता है।
- संज्ञाहरण के बाद, धीरे से माउस के सिर और गर्दन को पकड़ें ताकि नेत्रगोलक का एक तरफ थोड़ा सा फैल जाए। आंख के सही कोण पर आंख के कोने के साथ फ्लोरोसेंट ट्रेसर युक्त इंसुलिन सिरिंज डालें (सावधान रहें कि सिरिंज में कोई हवा पेश न करें)।
- पूरे अध्ययन में बाँझ स्थितियों को बनाए रखें और ऑटोक्लेविंग द्वारा उपकरणों को निष्फल करें। चूहों को दो समूहों में विभाजित करें।
- नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए SMG अलगाव निष्पादित करें।
नोट: सर्जरी के लिए ऊतक कैंची और पृथक्करण निकल सहित बाँझ उपकरणों का उपयोग करें।- एक एकतरफा ग्रंथि को सावधानी से अलग करें ताकि स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत आसपास की रक्त वाहिकाओं और नसों को नुकसान न पहुंचे।
- पैरासेलुलर पारगम्यता ट्रेसर के इंजेक्शन के बाद, जल्दी से चूहों को कार्डबोर्ड पर रखें और उन्हें अपने अंगों और सिरों को टेप करके लापरवाह स्थिति में रखें। माउस के बालों को हटाने के लिए गर्दन की त्वचा पर हेयर रिमूवल क्रीम लगाएं। सर्जरी से पहले त्वचा को कीटाणुरहित करने के लिए 75% इथेनॉल का उपयोग करें।
- फिर, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, एसएमजी के दोनों किनारों को उजागर करने के लिए सामान्य ऊतक कैंची के साथ गर्दन के एपिडर्मिस को काटें (इस प्रयोग में दाईं ग्रंथि का इलाज किया गया था)। इसके बाद, ग्रंथि की सतह से कैप्सूल को धीरे से अलग करने के लिए एक कुंद ऊतक पृथक्करण निकल ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें, इस बात का ध्यान रखें कि ग्रंथि ऊतक और रक्त वाहिकाओं को नुकसान न पहुंचे।
- ग्रंथियों की संरचना को नुकसान पहुंचाए बिना कैप्सूल को ग्रंथि की सतह से अलग करें। इसके अलावा, सुनिश्चित करें कि माउस संयम और ग्रंथि पृथक्करण की पूरी प्रक्रिया 10 मिनट के भीतर पूरी हो गई है।
- एक एकतरफा ग्रंथि को सावधानी से अलग करें ताकि स्टीरियोस्कोपिक माइक्रोस्कोप के तहत आसपास की रक्त वाहिकाओं और नसों को नुकसान न पहुंचे।
2. दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप सेट-अप
- अनुकूलित धारक को नकारात्मक दबाव डिवाइस से कनेक्ट करें, और जांचें कि क्या नकारात्मक दबाव प्रभाव पहले से ठीक से प्राप्त किया गया है।
नोट: धारक को केंद्र में गोल कांच के एक सपाट टुकड़े के साथ एक लघु आवर्धक ग्लास के आकार का बनाया गया है (व्यास: 4.32 मिमी, चित्रा 1)। नकारात्मक दबाव डिवाइस को इन-हाउस इस तरह से डिज़ाइन किया गया था कि धारक एक रबर ट्यूब से जुड़ा हुआ है, जो एक जल निकासी बोतल से जुड़ा हुआ है, और बोतल को एक छोटी रबर ट्यूब के माध्यम से नकारात्मक दबाव नियंत्रक से जोड़ा जाता है। इस तरह, नकारात्मक दबाव नियंत्रक यह सुनिश्चित करने के लिए दबाव को समायोजित कर सकता है कि ऊतक को धारक में चूसा जाता है।- नकारात्मक दबाव डिवाइस के साथ धारक के एक तरफ लिंक करें। यह जांचने के लिए कि क्या नकारात्मक दबाव डिवाइस बरकरार और उपयुक्त है, धारक को उल्टा घुमाएं, पानी की एक बूंद जोड़ें, और नकारात्मक दबाव मूल्य को 20 इकाइयों पर सेट करें। यदि पानी पूरी तरह से और जल्दी से चूसा जाता है, तो नकारात्मक दबाव डिवाइस सफलतापूर्वक धारक के साथ स्थापित किया जाता है।
- धीरे से माउस के उजागर एसएमजी को अनुकूलित धारक पर रखें, और श्वसन और अन्य स्थितियों के कारण गति कलाकृतियों को कम करने के लिए माउस शरीर से यथासंभव दूर नकारात्मक दबाव सक्शन द्वारा ऊतक को चूसें।
- 25x/NA 1.0 जल विसर्जन उद्देश्य (NIR के लिए विशेष) के तहत ग्रंथि से जुड़ी समर्थन सामग्री की छवि।
नोट: इस प्रयोग में एक सीधा दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें। ट्रेसर इंजेक्शन के बाद रक्त वाहिकाओं को स्पष्ट प्रतिदीप्ति के साथ तुरंत दिखाई देना चाहिए।
3. पोत इमेजिंग और पारगम्यता का पता लगाना
- ग्रंथि की दृष्टि चुने जाने के तुरंत बाद इमेजिंग शुरू करें।
नोट: आमतौर पर, 20 सेकंड या उससे अधिक समय में 45-50 छवियों की समय श्रृंखला आम तौर पर प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर कैप्चर की जाती है। - एक त्रि-आयामी (3 डी) निर्माण उत्पन्न करने के लिए ऊतक में ग्रंथि की सतह से 70-140 μm तक Z-अक्ष के साथ अनुक्रमिक छवियां प्राप्त करें।
- एसएमजी में संवहनी पारगम्यता को मापने के लिए वाहिकाओं की टाइम-लैप्स इमेजिंग प्राप्त करें।
नोट: माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर चलाने के बाद प्रोग्राम मेनू की शर्तों को निम्नानुसार सेट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।- Explorer संवाद बॉक्स में, नया फ़ोल्डर जोड़ें पर क्लिक करें और फ़ाइल का नाम परिवर्तित करें.
- अधिग्रहण स्तंभ पर वापस जाएँ। XY में, प्रारूप 512 x 512 है, और गति 400 हर्ट्ज है। द्विदिश X चालू करें.
- ज़ूम के लिए ज़ूम फैक्टर को 0.75 और 1.5 पर सेट करें।
- टाइम-लैप्स इमेजिंग प्राप्त करने के लिए, अधिग्रहण मोड के तहत xyt का चयन करें। प्रयोगात्मक आवश्यकता के अनुसार अवधि 20 सेकंड, 30 मिनट या उससे अधिक पर सेट करें।
- 3 डी निर्माण करने के लिए, अधिग्रहण मोड को xyz पर सेट करें। जेड-स्टेप आकार वास्तविक स्थिति के अनुसार सेट किया जा सकता है।
- शर्तों को सेट करने के बाद, फोटो बनाने वाले फ्रेम में दो चैनलों और ओवरलैपिंग चैनलों की संवहनी इमेजिंग का निरीक्षण करने के लिए लाइव पर क्लिक करें और रुचि के क्षेत्रों का चयन करें।
- इमेजिंग शुरू करने के लिए स्टार्ट पर क्लिक करें।
नोट: एनेस्थीसिया के तहत इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान माउस को लावारिस नहीं छोड़ा जाना चाहिए।
4. डेटा विश्लेषण
- पोत पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए, बाहर और अंदर के जहाजों के बीच एफडी 4 और आरडी 70 के प्रतिदीप्ति तीव्रता अनुपात की गणना करने के लिए इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और उन्हें अतिरिक्त और इंट्रावास्कुलर तीव्रता4 के रूप में निरूपित करें।
नोट: डेक्सट्रांस के परिवहन का पता लगाने के माध्यम से संवहनी पारगम्यता का परिवर्तन एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन में परिवर्तन को दर्शाता है। इसके अलावा, पोत परिवर्तनों के व्यास और संख्या की गणना करके संवहनी आकृति विज्ञान और घनत्व का निरीक्षण करें।- छवि जे सॉफ्टवेयर चलाएँ (सामग्री की तालिका देखें)।
- फ़ाइल पर क्लिक करें और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत कैप्चर की गई रक्त वाहिका छवियों को खोलने के लिए ओपन का चयन करें।
- छवि का चयन करें और छवि स्वरूप को कनवर्ट करने के लिए टाइप को 16-बिट पर सेट करें।
- विश्लेषण का चयन करें और सेट माप के तहत क्षेत्र, माध्य, इंटडेन का चयन करें। पुष्टि करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
- विश्लेषण के अंतर्गत, उपकरण का चयन करें, ROI Manger खोलें, और सभी और लेबल दिखाएँ का चयन करें.
- इंट्रावास्कुलर फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य को मापें: रक्त वाहिका की रूपरेखा को स्केच करने के लिए मुख्य इंटरफ़ेस पर लासो टूल पर क्लिक करें। ROI प्रबंधक में जोड़ें पर क्लिक करें। एकाधिक जहाजों का चयन जारी रखने के लिए इस चरण का पालन करें। ROI प्रबंधक के सभी ऑब्जेक्ट्स का चयन करें और माप पर क्लिक करें।
- कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता मान को मापें: पूरी छवि को रेखांकित करें, माप पर क्लिक करें, और परिणाम छवि का कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता मूल्य है।
- एक्स्ट्रावस्कुलर फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य की गणना करें। गणना के लिए Excel में डेटा की प्रतिलिपि बनाएँ. एक्स्ट्रावस्कुलर फ्लोरेसेंस तीव्रता अनुपात = (1 − इंट्रावास्कुलर फ्लोरेसेंस तीव्रता मान / कुल फ्लोरेसेंस तीव्रता मूल्य) × 100%।
5. डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग
- प्रयोग के दौरान, एक लाल कोशिका (दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत एक काले बिंदु के रूप में दिखाया गया) 4 की दूरी को मापकर रक्त प्रवाह दर की गणना करें।
- एंडोथेलियल कोशिकाओं में रक्त कोशिकाओं की गति की कल्पना करने के लिए, प्रतिदीप्ति द्वारा रक्त कोशिकाओं को लेबल करें। फिर, माउस पूंछ नस के माध्यम से एफडी 4 या आरडी 70 के साथ प्रतिदीप्ति-लेबल कोशिकाओं को इंजेक्ट करें। 5 मिनट के लिए घूमने के बाद, एक अवधि के लिए इच्छुक कोशिकाओं का पता लगाएं।
नोट: दाता चूहों की तिल्ली से प्राप्त कुल 2 x 106 सीएफएसई (कार्बोक्सीफ्लोरेसिन सक्सिनिमिडिल एस्टर, एक झिल्ली-पारगम्य फ्लोरोसेंट डाई) -लेबल लिम्फोसाइटों को पूंछ नस इंजेक्शन द्वारा प्राप्तकर्ताओं में स्थानांतरित किया गया था, और एसएमजी में लिम्फोसाइटों की घुसपैठ की जांच प्रयोगात्मक पशु मॉडल4 में की गई थी।
6. पशु देखभाल और वसूली
- पूरे प्रयोग के दौरान जानवरों की अच्छी देखभाल करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि सर्जरी से गुजरने वाले जानवर को प्रयोग के दौरान पूरी तरह से ठीक होने तक अन्य जानवरों की कंपनी में वापस नहीं किया जाता है। - जानवर को तब तक लावारिस न छोड़ें जब तक कि वह पर्याप्त चेतना प्राप्त न कर ले।
नोट: चूहों की श्वास स्थिति का लगातार निरीक्षण करें और उन्हें पशु हीटिंग पैड पर डालकर गर्म रखें। स्थानीय पशु नैतिकता समिति द्वारा अनुशंसित पोस्टसर्जिकल दर्द वसूली आवास और एनाल्जेसिया प्रदान करें।
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Representative Results
प्रोटोकॉल के बाद, एकतरफा एसएमजी को एक कस्टम-निर्मित धारक से जोड़ा गया था, और ग्रंथि को माउस शरीर से यथासंभव दूर रखा गया था ताकि श्वास को गति कलाकृतियों के कारण रोकने से रोका जा सके। माइक्रोस्कोप के तहत रक्त वाहिकाओं में लाल रक्त कोशिकाओं (काले बिंदुओं) का तेजी से प्रवाह देखा गया था। ओकुलर लेंस के तहत ऊतक क्षेत्र खोजने के बाद, किसी को माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में हेरफेर करने के लिए स्विच करना चाहिए। नियंत्रण समूह में, दोनों ट्रेसर माउस एसएमजी की रक्त वाहिकाओं में मौजूद थे। विशेष रूप से, इसके छोटे आणविक भार के कारण, एफडी 4 रक्त वाहिकाओं से एसिनी और नलिकाओं के बेसल किनारों तक रिसाव करने में सक्षम था, जिससे स्पष्ट रूप से एसिनी और नलिकाओं के आकार को दर्शाया गया था (जैसा कि ए और डी चित्रा 2 ए में बताते हैं)। इसके विपरीत, उच्च आणविक भार वाले डेक्सट्रांस, जैसे कि 40 केडीए और 70 केडीए, एसएमजी आकृति विज्ञान को अलग नहीं कर सके। दरअसल, आरडी 70 को बड़े आकार की रक्त वाहिकाओं और माइक्रोवाइल में प्रमुख रूप से वितरित किया गया था। डक्ट लिगेशन समूह में, एफडी 4 और आरडी 70 दोनों को एसिनी के बेसल किनारों पर अतिरिक्त रूप से रखा गया था, जिसने संकेत दिया कि डक्ट लिगेशन एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन को बाधित कर सकता है और फिर बड़े अणुओं के लिए पारगम्यता बढ़ा सकता है। अर्ध-मात्रात्मक एफडी 4 और आरडी 70 फ्लोरेसेंस तीव्रता परिणामों ने भी उपरोक्त घटनाओं की पुष्टि की (चित्रा 2 बी)। इसके अलावा, रक्त वाहिकाओं के व्यास में वृद्धि हुई थी, यह दर्शाता है कि 1 दिन के लिए वाहिनी बंधाव ने रक्त वाहिकाओं के फैलाव को प्रेरित किया। इसके अलावा, 3 डी छवियों ने लिगेशन समूह (चित्रा 2 सी) में रक्त वाहिकाओं के आसपास एफडी 4 और आरडी 70 की अधिक अस्पष्ट प्रतिदीप्ति दिखाई।
चित्रा 1: अनुकूलित धारक को दिखाने वाला एक योजनाबद्ध आरेख। धारक को केंद्र में गोल कांच के एक सपाट टुकड़े के साथ एक लघु आवर्धक ग्लास के आकार का बनाया जाता है (व्यास: 4.32 मिमी)। धारक का एक पक्ष कांच के नीचे ऊतकों को चूसने के लिए नकारात्मक दबाव उपकरण से जुड़ा हुआ है, जबकि धारक का दूसरा पक्ष मर चुका है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: विवो संवहनी पारगम्यता परख और चूहों सबमैंडिबुलर ग्रंथियों (एसएमजी) में रक्त वाहिकाओं की 3 डी छवियों में। चूहों को नियंत्रण और वाहिनी बंधाव समूहों में विभाजित किया गया था। दोनों समूहों में एकतरफा ग्रंथियों को उजागर और देखा गया था। (ए) विवो संवहनी पारगम्यता परख को कोणीय नस में 4 केडीए एफआईटीसी-लेबल डेक्सट्रान (एफडी 4) और 70 केडीए रोडामाइन बी-लेबल डेक्सट्रान (आरडी 70) इंजेक्ट करके किया गया था। एरोहेड एसएमजी में ट्रेसर के वितरण में परिवर्तन का संकेत देते हैं। ए, एसिनी। डी, वाहिनी। (बी) उपरोक्त छवियों के अर्ध-परिमाणीकरण विश्लेषण के लिए, प्रतिदीप्ति तीव्रता, जिसमें रक्त वाहिकाओं (इंट्रावास्कुलर) और बाहरी रक्त वाहिकाओं (एक्स्ट्रावस्कुलर) के भीतर एफडी 4 और आरडी 70 शामिल हैं, इमेज जे सॉफ्टवेयर द्वारा मापा गया था। (सी) एसएमजी में रक्त वाहिकाओं और माइक्रोवाइल की 3 डी छवियां। एरोहेड एसएमजी में ट्रेसर के वितरण में परिवर्तन का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
संवहनी होमियोस्टैसिस के लिए एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन का रखरखाव और विनियमन आवश्यक है। एंडोथेलियल कोशिकाएं और उनके अंतरकोशिकीय जंक्शन संवहनी अखंडता को बनाए रखने और नियंत्रित करने में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाते हैं। रक्त प्रवाह, विकास कारकों और भड़काऊ कारकों की कतरनी बल संवहनी पारगम्यता में परिवर्तन का कारण बन सकती है और इस प्रकार, उच्च रक्तचाप, मधुमेह और ऑटोइम्यून बीमारियों जैसे प्रणालीगत रोगों की घटना और विकास में भाग ले सकती है। लार ग्रंथि का संवहनी वितरण और रक्त प्रवाह सभी अंगों और ऊतकों में सबसे प्रचुर मात्रा में से एक है, लेकिन लार ग्रंथि की संवहनी प्रणाली पर शोध व्यापक रूप से नहीं किया गया है। लार ग्रंथि रक्त वाहिकाओं की गहरी और अधिक व्यापक समझ, विशेष रूप से एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन, लार स्राव के तंत्र के लिए नए सुराग प्रदान करेगा और संवहनी जीव विज्ञान अनुसंधान को बढ़ावा देगा।
विवो टू-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी तकनीक जानवर की बलि दिए बिना फ्लोरोसेंट डाई के अंतःशिरा इंजेक्शन द्वारा संवहनी पारगम्यता को निर्धारित कर सकती है। विभिन्न आणविक भार या आकार के माइक्रोसेफर्स के साथ प्रतिदीप्ति-लेबल डेक्सट्रांस एंडोथेलियल चोट की सीमा का बेहतर आकलन कर सकते हैं। इस बीच, संवहनी पारगम्यता के गतिशील कैनेटीक्स संवहनी पारगम्यता के इंट्रावाइटल मूल्यांकन प्रणाली का उपयोग करके वास्तविक समय में निर्धारित किए जाते हैं। एक और लाभ यह है कि रक्त वाहिकाओं के प्रकारों को अलग करना आसान है, जैसे कि धमनी, वेणु और केशिकाएं16। इसके अलावा, संवहनी एंडोथेलियल बाधा का विनाश और प्रतिरक्षा कोशिकाओं का प्रवास अनिवार्य रूप से सूजन से जुड़ा हुआ है, लेकिन एक ही कारक की जांच करने वाले कई अध्ययन हैं, और केवल कुछ अध्ययनों ने दोनों पहलुओं के बीच संबंध पर ध्यान केंद्रितकिया है 17,18. उहल एट अल ने हाल ही में विवो19 में एक साथ विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्करों के साथ फ्लोरेसेंस-लेबल डेक्सट्रांस और प्रतिरक्षा सेल-विशिष्ट एंटीबॉडी को इंजेक्ट करके लार ग्रंथि रोगों में विभिन्न रोगजनक कारकों की भूमिका का विश्लेषण करने के लिए एक शोध विधि स्थापित की। यहां, वर्तमान कामकाजी मॉडल में रोगजनन का पता लगाने के लिए पूंछ नस इंजेक्शन के माध्यम से प्रतिदीप्ति-लेबल प्रतिरक्षा कोशिकाओं का भी पता लगाया जा सकता है। इसलिए, वर्तमान प्रयोगात्मक विधि विवो में एसएमजी रोग पशु मॉडल में ल्यूकोसाइट एक्स्ट्रावेसन और एंडोथेलियल बैरियर अखंडता के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी प्रणाली प्रदान कर सकती है।
फिर भी, इस बात को नजरअंदाज नहीं किया जाना चाहिए कि एनेस्थेटिक्स के लिए चूहों की प्रतिक्रिया अलग है, और इमेजिंग समय जितना अधिक समय लगता है, एनेस्थीसिया समय की आवश्यकता उतनी ही अधिक होती है, और चूहों के लिए ठीक होना उतना ही कठिन होता है। इसलिए, इस प्रयोग का उपयोग यह जांचने के लिए बेहतर तरीके से किया जाता है कि इमेजिंग के बाद विवो प्रयोगों में कोई बाद की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अलावा, एक और सीमा यह है कि यह तकनीक लंबे समय की अवधि वाले प्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं है। डेक्सट्रांस पानी में घुलनशील और चयापचय करने में आसान होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप लंबे इमेजिंग समय के साथ कमजोर प्रतिदीप्ति होती है, और इस प्रकार, 30 मिनट के भीतर इमेजिंग समय बनाए रखना बेहतर होता है।
कुल मिलाकर, अध्ययन रक्त वाहिकाओं और माइक्रोवाइल से ग्रंथियों के ऊतकों में पैरासेलुलर पारगम्यता ट्रेसर और कोशिकाओं के प्रवेश पर केंद्रित है और माउस एसएमजी में एंडोथेलियल बैरियर फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए संवहनी पारगम्यता को मापने के लिए एक उन्नत विधि के रूप में कंट्रास्ट-एन्हांस्ड इंट्रावाइटल डायनेमिक टू-फोटॉन लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी को सख्ती से स्थापित किया गया है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 31972908, 81991500, 81991502, 81771093 और 81974151) और बीजिंग प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान 7202082) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-photon microscope (TCS-SP8 DIVE) | Leica, Germany | ||
| 4 kDa FITC-labeled dextran | Sigma Aldrich | 46944 | |
| 70 kDa rhodamine B-labeled dextran | Sigma Aldrich | R9379 | |
| Blunt tissue separation nickel | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| Depilatory cream | Veet | ||
| Disposable sterile syringe | Zhiyu Company | 1 mL | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | 0253316 | 1 mL |
| Leica Application Suite X software | Leica Microsystems | ||
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Phosphate buffered saline 1x | Servicebio | G4207-500 | |
| Tissue scissors | Bejinghuabo Company | M286-05 | |
| Tribromoethanol | JITIAN Bio | JT0781 |
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