Isolierung und direkte neuronale Reprogrammierung von Maus-Astrozyten
Summary
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung hochangereicherter Kulturen von Astrozyten, die aus verschiedenen Regionen des Zentralnervensystems postnataler Mäuse stammen, und deren direkte Umwandlung in funktionelle Neuronen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.
Abstract
Die direkte neuronale Reprogrammierung ist ein leistungsfähiger Ansatz, um funktionelle Neuronen aus verschiedenen Starterzellpopulationen zu erzeugen, ohne multipotente Zwischenprodukte zu durchlaufen. Diese Technik verspricht nicht nur im Bereich der Krankheitsmodellierung große Versprechungen, da sie es beispielsweise ermöglicht, Fibroblasten für Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen in Neuronen umzuwandeln, sondern stellt auch eine vielversprechende Alternative für zellbasierte Ersatztherapien dar. Ein großer wissenschaftlicher Durchbruch war in diesem Zusammenhang der Nachweis, dass differenzierte nicht-neuronale Zellen innerhalb des Zentralnervensystems, wie Astrozyten, in vitro in funktionelle Neuronen umgewandelt werden können. Seitdem hat die direkte In-vitro-Reprogrammierung von Astrozyten in Neuronen substanzielle Einblicke in die molekularen Mechanismen geliefert, die der erzwungenen Identitätsumwandlung zugrunde liegen, und die Hürden, die eine effiziente Reprogrammierung verhindern. Die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten, die in verschiedenen Labors durchgeführt wurden, sind jedoch aufgrund der Unterschiede in den Methoden zur Isolierung, Kultur und Neuprogrammierung von Astrozyten schwer zu vergleichen. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur zuverlässigen Isolierung und Kultivierung von Astrozyten mit hoher Reinheit aus verschiedenen Regionen des zentralen Nervensystems von Mäusen im postnatalen Alter mittels Magnetzellsortierung. Darüber hinaus bieten wir Protokolle zur Umprogrammierung kultivierter Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Transfektion an. Mit diesem schlanken und standardisierten Protokoll können die molekularen Mechanismen untersucht werden, die der Aufrechterhaltung der Zellidentität, der Etablierung einer neuen neuronalen Identität sowie der Generierung spezifischer neuronaler Subtypen und ihrer funktionellen Eigenschaften zugrunde liegen.
Introduction
Das zentrale Nervensystem (ZNS) von Säugetieren ist hochkomplex und besteht aus Hunderten von verschiedenen Zelltypen, darunter eine große Anzahl verschiedener neuronaler Subtypen 1,2,3,4,5,6. Im Gegensatz zu anderen Organen oder Geweben 7,8,9 hat das ZNS von Säugetieren eine sehr begrenzte Regenerationsfähigkeit; Der neuronale Verlust nach einer traumatischen Hirnverletzung oder Neurodegeneration ist irreversibel und führt häufig zu motorischen und kognitiven Defiziten10. Mit dem Ziel, Gehirnfunktionen zu retten, werden verschiedene Strategien zum Ersatz verlorener Neuronen intensiv untersucht11. Unter ihnen entwickelt sich die direkte Reprogrammierung von Körperzellen in funktionelle Neuronen zu einem vielversprechenden therapeutischen Ansatz12. Direkte Reprogrammierung oder Transdifferenzierung ist der Prozess der Umwandlung eines differenzierten Zelltyps in eine neue Identität, ohne einen intermediären proliferativen oder pluripotenten Zustand13,14,15,16 zu durchlaufen. Entwickelt durch die Identifizierung von MyoD1 als einen Faktor, der ausreicht, um Fibroblasten in Muskelzellenumzuwandeln 17,18, wurde diese Methode erfolgreich angewendet, um mehrere Zelltypen in funktionelle Neuronenumzuprogrammieren 19,20,21.
Astrozyten, die am häufigsten vorkommenden Makroglia im ZNS22,23, sind aus mehreren Gründen ein besonders vielversprechender Zelltyp für die direkte neuronale Reprogrammierung. Erstens sind sie weit und gleichmäßig über das ZNS verteilt und bieten eine reichlich vorhandene Lokquelle für neue Neuronen. Zweitens sind Astrozyten und Neuronen entwicklungseng miteinander verwandt, da sie während der Embryonalentwicklung einen gemeinsamen Vorfahren haben, die radialen Gliazellen24. Der gemeinsame embryonale Ursprung der beiden Zelltypen scheint die neuronale Umwandlung im Vergleich zur Reprogrammierung von Zellen aus verschiedenen Keimschichten zu erleichtern19,21. Darüber hinaus werden Musterinformationen, die von Astrozyten durch ihren radialen Glia-Ursprung geerbt werden, auch in erwachsenen Astrozyten 25,26,27 aufrechterhalten und scheinen zur Erzeugung regional geeigneter neuronaler Subtypen 28,29,30 beizutragen. Daher ist die Untersuchung und das Verständnis der Umwandlung von Astrozyten in Neuronen ein wichtiger Teil, um das volle Potenzial dieser Technik für zellbasierte Ersatzstrategien auszuschöpfen.
Die Umwandlung von in vitro kultivierten Astrozyten in Neuronen hat zu mehreren Durchbrüchen auf dem Gebiet der direkten neuronalen Reprogrammierung geführt, darunter: i) die Identifizierung von Transkriptionsfaktoren, die ausreichen, um Neuronen aus Astrozyten zu erzeugen15,19,31, ii) die Entschlüsselung molekularer Mechanismen, die durch verschiedene Reprogrammierungsfaktoren im selben zellulären Kontext ausgelöst werden 32 , und iii) Hervorhebung des Einflusses des Entwicklungsursprungs der Astrozyten auf die Induktion verschiedener neuronaler Subtypen28,29,33. Darüber hinaus löste die direkte In-vitro-Umwandlung von Astrozyten mehrere Haupthürden, die die direkte neuronale Reprogrammierung 34,35 begrenzen, wie z.B. eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) 34 und Unterschiede zwischen dem mitochondrialen Proteom von Astrozyten und Neuronen 35. Daher unterstützen diese Beobachtungen nachdrücklich die Verwendung von Primärkulturen von Astrozyten als Modell für die direkte neuronale Reprogrammierung, um mehrere grundlegende Fragen in der Biologiezu untersuchen 12, die sich auf die Aufrechterhaltung der Zellidentität, Straßensperren, die Veränderungen des Zellschicksals verhindern, sowie die Rolle des Stoffwechsels bei der Reprogrammierung beziehen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Astrozyten von Mäusen im postnatalen (P) Alter mit sehr hoher Reinheit, wie durch Isolierung von Astrozyten aus dem murinen Rückenmarkgezeigt wird 29. Wir bieten auch Protokolle zur Umprogrammierung von Astrozyten in Neuronen durch virale Transduktion oder DNA-Plasmid-Transfektion an. Reprogrammierte Zellen können 7 Tage nach der Transduktion (7 DPT) analysiert werden, um verschiedene Aspekte wie Reprogrammierungseffizienz und neuronale Morphologie zu beurteilen, oder sie können mehrere Wochen in Kultur gehalten werden, um ihre Reifung im Laufe der Zeit zu beurteilen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll nicht spezifisch für Rückenmarksastrozyten ist und leicht angewendet werden kann, um Astrozyten aus verschiedenen anderen Gehirnregionen zu isolieren, einschließlich der kortikalen grauen Substanz, des Mittelhirns und des Kleinhirns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primärkulturen muriner Astrozyten sind ein bemerkenswertes In-vitro-Modellsystem zur Untersuchung der direkten neuronalen Reprogrammierung. Tatsächlich exprimieren Zellen, obwohl sie in einem postnatalen Stadium isoliert wurden, typische Astrozytenmarker 29, behalten die Expression von Mustergenen28,29 bei und behalten die Fähigkeit zur Proliferation bei, ähnlich wie in vivo Astrozyten im vergleichbaren Altervon 38 Jahren.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ines Mühlhahn für das Klonen der Konstrukte für die Neuprogrammierung, Paulina Chlebik für die virale Produktion und Magdalena Götz und Judith Fischer-Sternjak für die Kommentare zum Manuskript.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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