ここでは、出生後マウスの中枢神経系のさまざまな領域に由来するアストロサイトの高度に濃縮された培養物を生成し、転写因子の強制発現によって機能的ニューロンに直接変換するための詳細なプロトコルについて説明します。
直接ニューロンリプログラミングは、多能性中間体を介さずに異なるスターター細胞集団から機能的ニューロンを生成する強力なアプローチです。この技術は、例えば、神経変性疾患に罹患している患者の線維芽細胞をニューロンに変換することを可能にするため、疾患モデリングの分野で大きな可能性を秘めているだけでなく、細胞ベースの補充療法の有望な代替手段でもある。この文脈において、主要な科学的ブレークスルーは、アストロサイトなどの中枢神経系内の分化した非神経細胞が、 インビトロで機能的ニューロンに変換できることの実証であった。それ以来、アストロサイトのニューロンへの インビトロ 直接リプログラミングは、強制的な同一性変換の根底にある分子メカニズムと、効率的なリプログラミングを妨げるハードルに関する実質的な洞察を提供してきました。しかし、異なるラボで行われた in vitro実験の結果は、アストロサイトの単離、培養、および再プログラムに使用される方法の違いにより、比較が困難です。ここでは、出生後のマウスの中枢神経系の異なる領域から、磁気細胞選別 を介して 高純度のアストロサイトを確実に単離・培養するための詳細なプロトコールについて述べる。さらに、培養したアストロサイトをウイルス形質導入またはDNAトランスフェクション を介して ニューロンに再プログラムするプロトコルも提供しています。この合理化され標準化されたプロトコルは、細胞同一性の維持、新しいニューロン同一性の確立、ならびに特定のニューロンサブタイプの生成およびそれらの機能的特性の根底にある分子メカニズムを調査するために使用することができる。
哺乳類の中枢神経系(CNS)は非常に複雑であり、膨大な数の異なるニューロンサブタイプ1、2、3、4、5、6を含む何百もの異なる細胞型からなる。他の器官または組織7、8、9とは異なり、哺乳動物CNSは非常に限られた再生能力を有する。外傷性脳損傷または神経変性に続くニューロン喪失は不可逆的であり、しばしば運動的および認知的欠損をもたらす10。脳機能を救うことを目指して、失われたニューロンを置き換えるためのさまざまな戦略が、激しい調査を受けている11。その中で、体細胞を機能的ニューロンに直接リプログラミングすることは、有望な治療的アプローチとして浮上している12。直接リプログラミング、または分化転換は、中間増殖性または多能性状態を経ることなく、1つの分化した細胞型を新しい同一性に変換するプロセスである13、14、15、16。線維芽細胞を筋細胞に変換するのに十分な因子としてのMyoD1の同定によって先駆的に開発された17,18、この方法は、いくつかの細胞型を機能的ニューロンに再プログラムするために首尾よく適用されてきた19、20、21。
アストロサイトは、CNS22、23において最も豊富なマクログリアであり、いくつかの理由から、直接ニューロンリプログラミングのために特に有望な細胞型である。第一に、それらはCNS全体に広く均等に分布しており、新しいニューロンのための豊富なロコ源を提供する。第2に、アストロサイトとニューロンは、胚発生中に共通の祖先、放射状グリア細胞24を共有するように、発達的に密接に関連している。2つの細胞型の共通の胚起源は、異なる胚葉からの細胞のリプログラミングと比較してニューロン変換を促進するようである19、21。さらに、その放射状グリア起源を介してアストロサイトによって受け継がれるパターニング情報は、成体アストロサイト25、26、27においても維持され、かつ、局所的に適切なニューロンサブタイプ28、29、30の生成に寄与するようである。したがって、アストロサイトのニューロンへの変換を調査および理解することは、細胞ベースの置換戦略のためのこの技術の可能性を最大限に引き出すための重要な部分です。
インビトロ培養アストロサイトのニューロンへの変換は、直接ニューロンリプログラミングの分野において、i)アストロサイトからニューロンを生成するのに十分な転写因子の同定15、19、31、ii)同じ細胞コンテキストにおける異なるリプログラミング因子によって引き起こされる分子機構の解明を含むいくつかのブレークスルーをもたらした32iii)異なるニューロンサブタイプの誘導に対するアストロサイトの発達起源の影響を強調する28、29、33。さらに、アストロサイトのインビトロ直接変換は、活性酸素種(ROS)産生の増加34およびアストロサイトとニューロン35のミトコンドリアプロテオームの違いなど、直接ニューロンリプログラミング34、35を制限するいくつかの主要なハードルを解明した。したがって、これらの観察は、細胞同一性の維持、細胞の運命の変化を防ぐ障害、およびリプログラミングにおける代謝の役割に関連する生物学12におけるいくつかの基本的な問題を調査するための直接ニューロンリプログラミングのモデルとしてのアストロサイトの初代培養の使用を強く支持する。
ここでは、マウス脊髄29からアストロサイトを単離することによって実証されるように、出生後(P)年齢のマウスから非常に高い純度でアストロサイトを単離するための詳細なプロトコルを提示する。また、ウイルス形質導入またはDNAプラスミドトランスフェクション を介して アストロサイトをニューロンに再プログラムするためのプロトコルも提供しています。リプログラミングされた細胞は、形質導入後7日間(7DPT)で分析して、リプログラミング効率やニューロン形態などのさまざまな側面を評価するか、または数週間培養中に維持して経時的な成熟を評価することができます。重要なことに、このプロトコルは脊髄アストロサイトに特異的ではなく、皮質灰白質、中脳、小脳を含む様々な他の脳領域からアストロサイトを単離するために容易に適用することができる。
マウスアストロサイトの初代培養物は、直接ニューロンのリプログラミングを研究するための注目すべきin vitroモデルシステムである。実際、出生後の段階で単離されるにもかかわらず、細胞は典型的なアストロサイトマーカー29を発現し、パターニング遺伝子28、29の発現を保持し、増殖する能力を維持し、同等の年齢におけるインビボ</…
The authors have nothing to disclose.
リプログラミングのためにコンストラクトをクローンしてくれたInes Mühlhahn、バイラル制作のためにPaulina Chlebik、原稿に対するコメントをしてくれたMagdalena GötzとJudith Fischer-Sternjakに感謝します。
0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
BDNF | Peprotech | 450-02 | |
bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | |
octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |