Isolamento e riprogrammazione neuronale diretta degli astrociti di topo
Summary
Qui descriviamo un protocollo dettagliato per generare colture altamente arricchite di astrociti derivati da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi postnatali e la loro conversione diretta in neuroni funzionali mediante l’espressione forzata di fattori di trascrizione.
Abstract
La riprogrammazione neuronale diretta è un approccio potente per generare neuroni funzionali da diverse popolazioni di cellule starter senza passare attraverso intermedi multipotenti. Questa tecnica non solo ha grandi promesse nel campo della modellazione delle malattie, in quanto consente di convertire, ad esempio, i fibroblasti per i pazienti affetti da malattie neurodegenerative in neuroni, ma rappresenta anche un’alternativa promettente per le terapie sostitutive basate sulle cellule. In questo contesto, un importante passo avanti scientifico è stata la dimostrazione che le cellule non neurali differenziate all’interno del sistema nervoso centrale, come gli astrociti, potrebbero essere convertite in neuroni funzionali in vitro. Da allora, la riprogrammazione diretta in vitro degli astrociti in neuroni ha fornito informazioni sostanziali sui meccanismi molecolari alla base della conversione forzata dell’identità e sugli ostacoli che impediscono una riprogrammazione efficiente. Tuttavia, i risultati di esperimenti in vitro eseguiti in diversi laboratori sono difficili da confrontare a causa delle differenze nei metodi utilizzati per isolare, coltivare e riprogrammare gli astrociti. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e coltivare in modo affidabile astrociti con elevata purezza da diverse regioni del sistema nervoso centrale dei topi in età postnatale tramite selezione di cellule magnetiche. Inoltre, forniamo protocolli per riprogrammare astrociti coltivati in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del DNA. Questo protocollo semplificato e standardizzato può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari alla base del mantenimento dell’identità cellulare, la creazione di una nuova identità neuronale, nonché la generazione di specifici sottotipi neuronali e le loro proprietà funzionali.
Introduction
Il sistema nervoso centrale (SNC) dei mammiferi è altamente complesso, costituito da centinaia di diversi tipi di cellule, tra cui un vasto numero di diversi sottotipi neuronali 1,2,3,4,5,6. A differenza di altri organi o tessuti 7,8,9, il SNC dei mammiferi ha una capacità rigenerativa molto limitata; la perdita neuronale a seguito di lesioni cerebrali traumatiche o neurodegenerazione è irreversibile e spesso si traduce in deficit motori e cognitivi10. Con l’obiettivo di salvare le funzioni cerebrali, diverse strategie per sostituire i neuroni persi sono oggetto di intense indagini11. Tra questi, la riprogrammazione diretta delle cellule somatiche in neuroni funzionali sta emergendo come un approccio terapeutico promettente12. La riprogrammazione diretta, o transdifferenziazione, è il processo di conversione di un tipo di cellula differenziata in una nuova identità senza passare attraverso uno stato proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Pioniere dell’identificazione di MyoD1 come fattore sufficiente per convertire i fibroblasti in cellule muscolari17,18, questo metodo è stato applicato con successo per riprogrammare diversi tipi di cellule in neuroni funzionali 19,20,21.
Gli astrociti, la macroglia più abbondante nel SNC22,23, sono un tipo di cellula particolarmente promettente per la riprogrammazione neuronale diretta per diversi motivi. In primo luogo, sono ampiamente e uniformemente distribuiti attraverso il SNC, fornendo un’abbondante fonte in loco per i nuovi neuroni. In secondo luogo, gli astrociti e i neuroni sono strettamente correlati allo sviluppo, in quanto condividono un antenato comune durante lo sviluppo embrionale, le cellule gliali radiali24. L’origine embrionale comune dei due tipi di cellule sembra facilitare la conversione neuronale rispetto alla riprogrammazione di cellule provenienti da diversi strati germinali19,21. Inoltre, le informazioni di pattern ereditate dagli astrociti attraverso la loro origine glia radiale sono mantenute anche negli astrociti adulti 25,26,27 e sembrano contribuire alla generazione di sottotipi neuronali appropriati a livello regionale 28,29,30. Quindi, studiare e comprendere la conversione degli astrociti in neuroni è una parte importante del raggiungimento del pieno potenziale di questa tecnica per le strategie di sostituzione basate sulle cellule.
La conversione di astrociti in coltura in vitro in neuroni ha portato a diverse scoperte nel campo della riprogrammazione neuronale diretta, tra cui: i) l’identificazione di fattori di trascrizione sufficienti a generare neuroni dagli astrociti 15,19,31, ii) il dipanarsi di meccanismi molecolari innescati da diversi fattori di riprogrammazione nello stesso contesto cellulare 32 , e iii) evidenziando l’impatto dell’origine evolutiva degli astrociti sull’induzione di diversi sottotipi neuronali 28,29,33. Inoltre, la conversione diretta in vitro degli astrociti ha svelato diversi ostacoli importanti che limitano la riprogrammazione neuronale diretta34,35, come l’aumento della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS)34 e le differenze tra il proteoma mitocondriale degli astrociti e i neuroni35. Quindi, queste osservazioni supportano fortemente l’uso di colture primarie di astrociti come modello per la riprogrammazione neuronale diretta per indagare diverse questioni fondamentali in biologia12, relative al mantenimento dell’identità cellulare, agli ostacoli che impediscono i cambiamenti del destino cellulare e al ruolo del metabolismo nella riprogrammazione.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per isolare astrociti da topi in età postnatale (P) con purezza molto elevata, come dimostrato isolando astrociti dal midollo spinale murino29. Forniamo anche protocolli per riprogrammare gli astrociti in neuroni tramite trasduzione virale o trasfezione del plasmide del DNA. Le cellule riprogrammate possono essere analizzate a 7 giorni dopo la trasduzione (7 DPT) per valutare vari aspetti, come l’efficienza di riprogrammazione e la morfologia neuronale, oppure possono essere mantenute in coltura per diverse settimane, per valutarne la maturazione nel tempo. È importante sottolineare che questo protocollo non è specifico per gli astrociti del midollo spinale e può essere prontamente applicato per isolare gli astrociti da varie altre regioni del cervello, tra cui la materia grigia corticale, il mesencefalo e il cervelletto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le colture primarie di astrociti murini sono un notevole sistema modello in vitro per studiare la riprogrammazione neuronale diretta. Infatti, nonostante siano isolate in uno stadio postnatale, le cellule esprimono i tipici marcatori astrocitari29, mantengono l’espressione dei genipatterning 28,29 e mantengono la capacità di proliferare, simile agli astrociti in vivo ad un’età comparabiledi 38 an…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Ines Mühlhahn per aver clonato i costrutti per la riprogrammazione, Paulina Chlebik per la produzione virale e Magdalena Götz e Judith Fischer-Sternjak per i commenti sul manoscritto.
Materials
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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