En ansigt Endokardial pudepræparat til plan morfogeneseanalyse i museembryoner
Summary
Klassisk er endokardiet af musens embryonale ventil primordium blevet analyseret ved hjælp af tværgående, koronale eller sagittale sektioner. Vores nye tilgang til en face, todimensionel billeddannelse af endokardiet i valvulogene regioner tillader plan polaritet og celleomlejringsanalyse af endokardiet under ventiludvikling.
Abstract
Undersøgelsen af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af pattedyrshjertet, er afgørende for at løse menneskelig medfødt hjertesygdom. Udviklingen af de primitive hjerteventiler involverer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) af endokardialceller fra atrioventrikulær kanal (AVC) og udstrømningskanal (OFT) regioner i hjertet som reaktion på lokale induktive myokardie- og endokardiale signaler. Når cellerne delaminerer og invaderer den ekstracellulære matrix (hjertegelé), der er placeret mellem endokardiet og myokardiet, dannes de primitive endokardiepuder (EC). Denne proces indebærer, at endokardiet skal udfylde hullerne efter de delaminerede celler og skal omorganisere sig for at konvergere (smal) eller strække sig (forlænges) langs en akse. Nuværende forskning har impliceret den plane cellepolaritet (PCP) vej til regulering af den subcellulære lokalisering af de faktorer, der er involveret i denne proces. Klassisk set er de indledende faser af udviklingen af hjerteklappen blevet undersøgt i tværsnit af embryonale hjerter eller i ex vivo AVC- eller OFT-eksplanter, der dyrkes på kollagengeler. Disse tilgange tillader analyse af apico-basal polaritet, men tillader ikke analyse af celleadfærd inden for epitelets plan eller af de morfologiske ændringer af migrerende celler. Her viser vi en eksperimentel tilgang, der tillader visualisering af endokardiet ved valvulogene regioner som et plant felt af celler. Denne eksperimentelle tilgang giver mulighed for at studere PCP, plan topologi og intercellulær kommunikation inden for endokardiet i OFT og AVC under ventiludvikling. Dekryptering af nye cellulære mekanismer involveret i hjerteventilmorfogenese kan bidrage til at forstå medfødt hjertesygdom forbundet med endokardiale pudefejl.
Introduction
Hjertet er det første funktionelle organ i et pattedyrembryo. Omkring fosterdag (E) 7,5 hos mus danner bilaterale prækardiale mesodermceller hjertehalvmånen i den ventrale side1. Hjertehalvmånen indeholder to populationer af prækardiale celler, der omfatter forfædre til myokardiet og endokardiet2. Omkring E8.0 smelter hjerteforstadierne sammen i midterlinjen og danner det primitive hjerterør bestående af to epitelvæv, det ydre myokardium og det indre endokardium, som er et specialiseret endotel adskilt af en ekstracellulær matrix ved navn hjertegelé. Senere, ved E8.5, gennemgår hjerterøret højre looping. Det loopede hjerte har forskellige anatomiske regioner med specifikke molekylære signaturer såsom udstrømningskanalen (OFT), ventriklerne og atrio-ventrikulær kanal (AVC)3. Selvom hjerterøret oprindeligt udvider sig ved sin tilstrømningsside gennem tilsætning af celler4, ved E9.5, resulterer intensiv hjerteproliferation i ballondannelse af kamrene og etablering af det trabekulære netværk5. Ventildannelse finder sted i AVC (fremtidige mitral- og tricuspidventiler) og i OFT (fremtidige aorta- og lungeventiler).
Endokardiet spiller afgørende roller i ventiludvikling. Endokardiale celler gennemgår epitel-mesenkymal overgang (EMT) i AVC og OFT for at danne endokardialpuderne, en struktur, der vises ved begyndelsen af ventiludviklingen. Forskellige signalveje aktiverer denne proces; ved E9.5 hos mus fremmer NOTCH aktiveret i endokardiet som reaktion på myokardieafledt BMP2 invasiv EMT af endokardieceller i AVC- og OFT-regionerne gennem aktivering af TGFβ2 og SNAIL (SNAI1), som direkte undertrykker ekspressionen af vaskulær endotelcadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i klæbende kryds (AJ’er)6,7,8 . I OFT medieres aktivering af endokardiet for at initiere EMT af FGF8 og BMP4, hvis udtryk aktiveres af NOTCH 9,10,11,12.
Progression af EMT involverer cellulær dynamik, når celler ændrer form, bryder og genskaber kryds med deres naboer, delaminerer og begynder at migrere13. Disse ændringer omfatter AJ-ombygning og gradvis demontering af 14,15, plan cellepolaritet (PCP) signalering, tab af apico-basal polaritet (ABP), apikal indsnævring og cytoskeletal organisation 16,17. ABP refererer til fordelingen af proteiner langs den forreste bageste akse af en celle. I det udviklende hjerte kræves ABP-regulering i kardiomyocytter til ventrikulær udvikling18. PCP refererer til en polariseret fordeling af proteiner i celler på tværs af et vævs plan og regulerer cellulær fordeling; epitel med en stabil geometri består af sekskantformede celler, hvor kun tre celler konvergerer ved hjørnerne 19,20,21,22. Forskellige cellulære processer, såsom celledeling, naboudveksling eller delaminering, der forekommer under epitelmorfogenese, producerer en stigning i antallet af celler, der konvergerer på et toppunkt, og antallet af naboceller, som en given celle har22. Disse cellulære adfærd relateret til PCP kan reguleres af forskellige signalveje, actindynamik eller intracellulær handel23.
De data, der genereres ved at studere ventiludvikling hos mus, er opnået fra tværgående, koronale eller sagittale sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet vises som en cellelinje i stedet for som et felt af celler – endokardiet dækker hele den indre overflade af hjerterøret24. Embryonale sektioner tillader ikke analyse af PCP i endokardiet af museembryoner. Vores nye eksperimentelle metode tillader analyse af endokardialcellefordeling, AJ-anisotropi og enkeltcelleformanalyse, som vist i de repræsentative resultater. Denne type data er nødvendig for PCP-analyse sammen med beskrivelsen af andre molekyler relateret til PCP, som ikke er vist i denne rapport. Helmonteret immunfluorescens, specifik prøveforberedelse og anvendelse af genetisk modificerede mus muliggør plan polaritetsanalyse i endokardiet ved begyndelsen af ventiludvikling hos mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Endokardiet er et epitelmonolag, der dækker hele den indre overflade af det embryonale hjerterør. Under ventiludvikling gennemgår endokardialceller i de potentielle valvulære regioner EMT, således omdanner endokardialceller og omarrangerer deres cytoskelet for at delaminere fra endokardiet mod hjertegeléen. Vi og andre har opnået relevante data om ventiludvikling i museembryoner ved at analysere tværgående sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en række celler<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud PID2019-104776RB-I00 og CB16/11/00399 (CIBER CV) fra MCIN/AEI/10.13039/501100011033 til J. L. P. J.G.-B. blev finansieret af Programa de Atracción de Talento fra Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. blev finansieret af Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi takker CNIC-enheden for mikroskopi og dynamisk billeddannelse, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansieret af MCIN/AEI /10.13039/501100011033 og FEDER “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi takker også A. Galicien og L. Méndez for museopdræt. Udgifterne til denne publikation blev delvist støttet af midler fra Den Europæiske Fond for Regionaludvikling. CNIC er støttet af ISCIII, MCIN og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (tilskud CEX2020-001041-S) finansieret af MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
