En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo
Summary
Classicamente, l’endocardio del primordium della valvola embrionale di topo è stato analizzato utilizzando sezioni trasversali, coronali o sagittali. Il nostro nuovo approccio per l’imaging bidimensionale dell’endocardio nelle regioni valvulogeniche consente l’analisi della polarità planare e del riarrangiamento cellulare dell’endocardio durante lo sviluppo della valvola.
Abstract
Lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo del cuore dei mammiferi è essenziale per affrontare la cardiopatia congenita umana. Lo sviluppo delle valvole cardiache primitive comporta la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) delle cellule endocardiche dalle regioni del canale atrioventricolare (AVC) e del tratto di efflusso (OFT) del cuore in risposta a segnali miocardici ed endocardici induttivi locali. Una volta che le cellule si delaminatono e invadono la matrice extracellulare (gelatina cardiaca) situata tra l’endocardio e il miocardio, si formano i cuscinetti endocardici primitivi (EC). Questo processo implica che l’endocardio deve riempire gli spazi vuoti lasciati dalle cellule delaminate e deve riorganizzarsi per convergere (stretto) o estendersi (allungarsi) lungo un asse. La ricerca attuale ha implicato il percorso di polarità cellulare planare (PCP) nella regolazione della localizzazione subcellulare dei fattori coinvolti in questo processo. Classicamente, le fasi iniziali dello sviluppo valvolare cardiaco sono state studiate in sezioni trasversali di cuori embrionali o in espianti ex vivo AVC o OFT coltivati su gel di collagene. Questi approcci permettono l’analisi della polarità apico-basale ma non permettono l’analisi del comportamento cellulare all’interno del piano dell’epitelio o dei cambiamenti morfologici delle cellule migranti. Qui, mostriamo un approccio sperimentale che consente la visualizzazione dell’endocardio nelle regioni valvulogeniche come un campo planare di cellule. Questo approccio sperimentale offre l’opportunità di studiare PCP, topologia planare e comunicazione intercellulare all’interno dell’endocardio dell’OFT e dell’AVC durante lo sviluppo della valvola. Decifrare nuovi meccanismi cellulari coinvolti nella morfogenesi delle valvole cardiache può contribuire alla comprensione della cardiopatia congenita associata a difetti del cuscino endocardico.
Introduction
Il cuore è il primo organo funzionale di un embrione di mammifero. Intorno al giorno embrionale (E) 7,5 nei topi, le cellule bilaterali del mesoderma precardiaco formano la mezzaluna cardiaca nel lato ventrale1. La mezzaluna cardiaca contiene due popolazioni di cellule precardiache che includono progenitori del miocardio e dell’endocardio2. Intorno a E8.0, i precursori cardiaci si fondono nella linea mediana, formando il tubo cardiaco primitivo costituito da due tessuti epiteliali, il miocardio esterno e l’endocardio interno, che è un endotelio specializzato separato da una matrice extracellulare chiamata gelatina cardiaca. Successivamente, a E8.5, il tubo cardiaco subisce un ciclo verso destra. Il cuore ad anello ha diverse regioni anatomiche con firme molecolari specifiche come il tratto di efflusso (OFT), i ventricoli e il canale atrio-ventricolare (AVC)3. Sebbene inizialmente il tubo cardiaco si espanda sul suo lato di afflusso attraverso l’aggiunta di cellule4, a E9.5, un’intensa proliferazione cardiaca provoca il palloncino delle camere e la creazione della rete trabecolare5. La formazione valvolare avviene nell’AVC (future valvole mitrale e tricuspide) e nell’OFT (future valvole aortica e polmonare).
L’endocardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della valvola. Le cellule endocardiche subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nell’AVC e nell’OFT per formare i cuscini endocardici, una struttura che appare all’inizio dello sviluppo valvolare. Diverse vie di segnalazione attivano questo processo; a E9.5 nei topi, NOTCH attivato nell’endocardio in risposta al BMP2 derivato dal miocardio promuove l’EMT invasiva delle cellule endocardiche nelle regioni AVC e OFT attraverso l’attivazione di TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), che reprime direttamente l’espressione della caderina endoteliale vascolare (VE-caderina), una componente transmembrana delle giunzioni aderenti (AJ)6,7,8 . Nell’OFT, l’attivazione dell’endocardio per iniziare l’EMT è mediata da FGF8 e BMP4, la cui espressione è attivata da NOTCH 9,10,11,12.
La progressione dell’EMT coinvolge la dinamica cellulare mentre le cellule cambiano forma, rompono e ricreano le giunzioni con i loro vicini, si delaminano e iniziano a migrare13. Questi cambiamenti includono il rimodellamento di AJ e il graduale disassemblaggio 14,15, la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP), la perdita della polarità apico-basale (ABP), la costrizione apicale e l’organizzazione citoscheletrica 16,17. ABP si riferisce alla distribuzione delle proteine lungo l’asse antero-posteriore di una cellula. Nel cuore in via di sviluppo, la regolazione dell’ABP nei cardiomiociti è necessaria per lo sviluppo ventricolare18. PCP si riferisce a una distribuzione polarizzata di proteine all’interno delle cellule attraverso il piano di un tessuto e regola la distribuzione cellulare; Gli epiteli con una geometria stabile sono costituiti da cellule di forma esagonale, dove solo tre celle convergono ai vertici 19,20,21,22. Diversi processi cellulari, come la divisione cellulare, lo scambio di vicini o la delaminazione che si verificano durante la morfogenesi epiteliale, producono un aumento del numero di cellule che convergono su un vertice e il numero di cellule vicine che una data cellula ha22. Questi comportamenti cellulari correlati alla PCP possono essere regolati da diverse vie di segnalazione, dinamica dell’actina o traffico intracellulare23.
I dati generati studiando lo sviluppo valvolare nei topi sono stati ottenuti da sezioni trasversali, coronali o sagittali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l’endocardio è mostrato come una linea di cellule anziché come un campo di cellule: l’endocardio copre l’intera superficie interna del tubo cardiaco24. Le sezioni embrionali non consentono l’analisi del PCP nell’endocardio degli embrioni di topo. Il nostro nuovo metodo sperimentale consente l’analisi della distribuzione delle cellule endocardiche, dell’anisotropia AJ e dell’analisi della forma a singola cellula, come mostrato nei risultati rappresentativi. Questo tipo di dati è necessario per l’analisi del PCP, insieme alla descrizione di altre molecole correlate al PCP, non mostrate in questo rapporto. L’immunofluorescenza a montaggio intero, la preparazione di campioni specifici e l’uso di topi geneticamente modificati consentono l’analisi della polarità planare nell’endocardio all’inizio dello sviluppo valvolare nei topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’endocardio è un monostrato epiteliale che copre l’intera superficie interna del tubo cardiaco embrionale. Durante lo sviluppo valvolare, le cellule endocardiche nelle regioni valvolari prospettiche subiscono EMT, quindi le cellule endocardiche trasformano e riorganizzano il loro citoscheletro per delaminarsi dall’endocardio verso la gelatina cardiaca. Noi e altri abbiamo ottenuto dati rilevanti sullo sviluppo valvolare in embrioni di topo analizzando sezioni trasversali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l’endocar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. è stato finanziato dal Programa de Atracción de Talento della Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. è stato finanziato da Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Si ringraziano l’Unità CNIC di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, ICTS-ReDib, co-finanziata da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FESR “A way to make Europe” (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Ringraziamo anche A. Galicia e L. Méndez per l’allevamento dei topi. Il costo di questa pubblicazione è stato in parte sostenuto da fondi del Fondo europeo di sviluppo regionale. Il CNIC è sostenuto dall’ISCIII, dal MCIN e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Centro di Eccellenza Severo Ochoa (sovvenzione CEX2020-001041-S) finanziato da MCIN/AEI /10.13039/501100011033.
Materials
| 4-OH-Tamoxifen | Sigma Aldrich | H-6278 | |
| 16 % Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 157-10 | Dilute to 4% in water |
| anti-GFP | Aves Labs | FGP-1010 | |
| anti-VECadherin | BD Biosciences | 555289 | |
| Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11039 | |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 115-605-174 | |
| DAPI | AppliChem | A4099,0005 | |
| Slides Superfrost PLUS | VWR | 631-0108 | 25 mm x 75 mm x 1.0 mm |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Tween 20 | A4974,0500 | AppliChem | |
| Vectashield Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000-10 |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Ivanovitch, K., et al. outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak. PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).
- Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. Signaling pathways controlling second heart field development. Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).
- Moorman, A. F., Christoffels, V. M. Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution. Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).
- Timmerman, L. A., et al. Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation. Genes & Development. 18 (1), 99-115 (2004).
- Luna-Zurita, L., et al. Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation. Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).
- Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium. Development. 145 (13), (2018).
- MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. Notch signaling in cardiac valve development and disease. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).
- de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease. Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).
- Wu, B., et al. Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation. Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).
- Amack, J. D. Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development. Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).
- Cano, A., et al. The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression. Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).
- Batlle, E., et al. The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells. Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).
- Weng, M., Wieschaus, E. Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly. Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).
- Weng, M., Wieschaus, E. Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning. Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).
- Jimenez-Amilburu, V., et al. In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation. Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).
- Davey, C. F., Moens, C. B. Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally. Development. 144 (2), 187-200 (2017).
- Grego-Bessa, J., et al. The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium. Elife. 5, 12034 (2016).
- Jones, C., Chen, P. Planar cell polarity signaling in vertebrates. Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).
- Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo. Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).
- Devenport, D. Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors. Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).
- Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop. Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).
- Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence. Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).
- Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells. Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Wang, Y., et al. Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis. Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).
- Yilmaz, M., Christofori, G. EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion. Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).
- Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure. Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).
- Prados, B., et al. Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity. Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).
- Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan. Experimental & Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).
- Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. Influence of blood flow on cardiac development. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).
- Goddard, L. M., et al. Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis. Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).
